禽类胚胎细胞的制备
【专利说明】禽类胚胎细胞的制备
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年3月5日提交的美国申请编号13/785513的权益。
[0003] 本发明涉及由禽胚制备细胞的组合物和方法。本发明还涉及这些细胞的培养物及 其用途，尤其是用于生产病毒如MDV的用途。本发明还涉及使用这些细胞或病毒制备疫苗 的方法。
【背景技术】
[0004] 受精的禽蛋，如鸡蛋，是生产人类和兽用疫苗的主要基质之一。使用它们的原因是 它们能够支持包括复制缺陷型病毒的多种多样的人和动物病毒的复制。在禽类胚胎细胞中 生产的疫苗的实例包括例如MDV疫苗、禽呼肠孤病毒疫苗和传染性法氏囊病病毒疫苗。
[0005] 在禽类胚胎细胞中生产疫苗需要由无特定病原体的（SPF)禽群持续可靠地提供 受精卵。SPF禽群被饲养于特殊环境下并且定期被证明为无禽类病原体（D.H. Thornton， "马立克氏病：科学依据和控制方法：疫苗的质量控制和标准化（Marel s Diseases: Scientific Basis and Methods of Control ：quality control and standardization of vaccines.) "（L. N. Payne，Ed.)，Martinus Nijoff Publishing，波士顿，MA，第 267-292 页 (1985))。从蛋中获得胚胎，将其断头，然后进行处理（通常通过机械和/或酶处理）从而 生产初生胚胎细胞，通常是胚胎成纤维细胞。通常，将胚胎与头分离并收集在烧杯中。然后 将仅有身体的胚胎转移至胰蛋白酶培养瓶，其中在冷胰蛋白酶（比室温冷）中所述胚胎被 胰蛋白酶化（trypsinized)3次，每次10分钟。将包含分离的细胞的消化缓冲液倾倒通过 筛网（Imm目径）至含血清的酸瓶中。通过离心浓缩收集的CEF，并且将其冷冻直至使用。
[0006] 然后可以培养这些细胞并将其用于生产病毒。
[0007] 例如，目前的马立克氏病疫苗是感染的鸡胚细胞（CEF)的悬液，或由感染有马立 克氏病病毒疫苗株的超声粉碎的CEF制得的无细胞病毒悬液（A.E. Churchill，"马立克 氏病：科学依据和控制方法：疫苗的生产（Marel s Diseases :Scientific Basis and Methods of Control production of vaccines) (L. N. Payne, Ed. ), Martinus Nijoff Publishing，波士顿，MA，第 251-266 页（1985))。
[0008] 与所有初生动物细胞一样，禽胚成纤维细胞会经历衰老，倍增时间逐代增加直至 细胞最终死亡。初生禽胚细胞如鸡胚细胞（CEF)的有限寿命为大约两到三周。因此，为了 维持疫苗生产，必须每隔一或两周制备这些细胞，这增加了生产疫苗的成本。
[0009] 为了克服对初生细胞的需要及对受精卵的使用，已经尝试开发永生化的禽类细胞 系（参见例如K.Nazerian，Avian Pathol. 16:527-544(1987))。然而，这些细胞系来自病 毒转化的细胞，或在接种到鸡中时产生肿瘤，或产生不足以商业生产的病毒滴度。因此，在 疫苗生产中这些细胞系不能替代初生禽胚成纤维细胞。
[0010] 本发明提供了一种改进适合于疫苗生产的禽类胚胎细胞生产的可选方法。本发明 公开了一种用于从完整胚胎生产适合疫苗接种的初生禽类细胞的改进方法。该方法提高了 产生的细胞的数量且因此降低了疫苗生产的成本。
【发明内容】
[0011] 本发明涉及生产初生禽胚细胞的改进方法。本发明还涉及这些细胞及其生产疫苗 或其它生物产品的用途。
[0012] 本发明尤其源于从完整胚胎生产细胞的新方法的开发。呈现的结果显示这种方 法提供了提高的每个胚胎的细胞数量，并且显示这些细胞展示了适于商业疫苗生产的特征 (密度、融合度、病毒生产滴度）。更具体地呈现的结果显示该方法产生的CEF/胚胎产量是 现有技术实现的产量的大约两倍，并且允许以更高的密度接种细胞，和在感染后大约50小 时进行收获，从而实现高于最低释放量的滴度。因此与使用建立的细胞系或常规仅有身体 的胚胎细胞的现有技术的方法相比，这种方法具有很大优势。
[0013] 因此本发明的一个目的在于制备禽类胚胎细胞的方法，其包含：
[0014] a)由禽蛋获得禽胚，和
[0015] b)由完整胚胎制备细胞。
[0016] 在一个优选的实施方案中，该方法还包含步骤c):以20微米以上，更优选以50微 米以上对细胞制备物进行过滤。
[0017] 本发明的另一个目的在于由胚胎制备禽类胚胎细胞的改进的方法，改进在于由完 整胚胎制备细胞及随后以20微米以上过滤细胞制备物。
[0018] 在本发明方法的特定实施方案中，在过滤步骤c)之前或之后可以培养或扩增禽 类胚胎细胞；和/或在过滤步骤c)之前或之后禽类胚胎细胞可以被病毒感染。
[0019] 禽蛋优选为无特定病原体的禽蛋。并且，禽类胚胎细胞优选为成纤维细胞。本发 明可用于任何禽类，优选鸡或鸭。在生产后，可以将细胞维持在培养物中，优选维持在无血 清培养基中。
[0020] 本发明的另一个目的涉及通过以上公开的方法可获得或获得的禽类胚胎细胞或 所述细胞的祖细胞的培养物或组合物。
[0021] 本发明还涉及禽类胚胎细胞的培养物或组合物，其中所述细胞或其祖先由完整胚 胎制备得到且已经以20微米以上进行过过滤。
[0022] 优选地，细胞为鸡胚成纤维细胞，任选地被病毒如马立克氏病病毒（MDV)感染。
[0023] 本发明的另一个目的涉及生产或扩增病毒的方法，包括用病毒感染上述细胞以及 任选地收集所产生的病毒。随后可将生产或扩增的病毒灭活。病毒可以为任何动物或人类 病毒，例如但不限于MDV、火鸡疱疹病毒、MDV(SB-I)或MDV(Rispens)、禽呼肠孤病毒和传染 性法氏囊病病毒。
[0024] 本发明还涉及生产病毒疫苗的方法，包含（i)在允许病毒生产或扩增的条件下用 病毒感染上述细胞；（ii)任选地，收集生产或扩增的病毒；（iii)任选地，将在（i)或（ii) 中所生产或扩增的病毒灭活；以及（iv)将生产或扩增的病毒配制为疫苗组合物。
[0025] 在该方法的一个特定的实施方案中，将生产或扩增的病毒收集、分离、以20微米 以上过滤、任选地灭活、并配制为疫苗组合物。
[0026] 根据另一个特定的实施方案，在步骤（i)之前将细胞以20微米以上进行过滤，并 且将细胞上清液或细胞碎片用于生产疫苗。
[0027] 本发明还涉及疫苗组合物，其包含上述的或通过上述方法获得的病毒或细胞，以 及合适的赋形剂或载体。
[0028] 本发明尤其适合生产CEF和使用这些细胞生产MDV疫苗。
【附图说明】
[0029] 本专利或申请文件包含至少一副彩图。具有彩图的本专利或专利申请出版物的副 本经要求并支付必要费用后会由专利局提供。
[0030] 图1 :由完整胚胎制备的CEF的存活研究。
[0031] 图2 :由完整胚胎制备的CEF的融合度研究
[0032] 图3 :由完整胚胎制备的CEF细胞上马立克氏病毒的生长。 具体实施方案