改进的ngs工作流程的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸序列分析领域。具体地，本发明涉及关于下一代测序（NGS)的方 法和工具。DNA测序是一种用于破译一些人类疾病（所述疾病包含涉及癌症的形成的不同 类型的基因）的有力方法。
【背景技术】
[0002] 下一代测序（NGS)技术的出现成数量级地降低了测序成本并且显著地增加了通 量，从而使全基因组测序成为用于获得关于可被采取临床措施的患者的整体基因组信息的 可行方式。DNA测序可被用于确定个别基因、较大基因区域（即，基因或操纵子的簇）、全部 染色体或整个基因组的序列。取决于使用的方法，测序可以提供DNA中或从动物、植物、细 菌等的细胞或者实际上任何其他基因信息源分离的核苷酸的序列。得到的序列可被分子生 物学或遗传学的研究者使用，并且可被用于进一步的科学进程，或者可被医务人员用来做 出治疗决策或帮助基因咨询。后两种用途经常在具有个体化治疗或伴随诊断应用的背景中 引用。
[0003] 无论NGS技术提供多大的利益，在NGS技术可以从研究工具变成常规临床实践之 前必须充分解决一些挑战。为了诊断目的的NGS技术应当需要尽可能少的手动步骤，包括 适当机制以防止被源于临床样品（所述临床样品在给定时间点进行分析）之外的其他来 源的核酸材料污染，并且所述方法应当快速并且应当被在临床实验室工作的人员容易地执 行。
[0004] 已经发展了不同NGS技术，其涉及多种物理-化学机制，导致相应核酸序列分析中 使用不同方法。这些技术在本技术领域中通常是已知的。最广泛应用的技术是离子半导体 (Ion Torrent)测序、焦磷酸测序和合成测序（Illumina)0
[0005] 已经一般性描述了本发明的方法，将更详细地描述所述方法的每个方面。
[0006] 如本文使用的，被测序的核酸称为目标核酸（或目标）。目标核酸包括但不限于 DNA(例如但不限于基因组DNA、线粒体DNA、cDNA等）和RNA(例如但不限于mRNA、miRNA)， 等。目标核酸可来源于任何来源（包括天然存在的来源或合成来源）。核酸可以是PCR产 物、粘粒、质体、天然存在或者合成库的成员或种类等。本发明不意在限于此点。核酸可以 来自动物或病原体来源，包括但不限于哺乳动物（例如人）和微生物（例如细菌、病毒、真 菌、寄生物和分枝杆菌）。在某些实施方式中，核酸不是病毒核酸。目标核酸可以从任何体 液或组织（包括但不限于血液、唾液、脑脊髓液（"CSF"）、皮肤、毛发、尿液、大便和粘液） 获得。目标核酸可还来源于但不限于，环境样品（例如水的样品）、食品样品、或法医样品， 所述样品可以是新鲜样品（例如，直接进行核酸提取的活检材料）或者已被处理以便允许 存储的样品（例如，被福尔马林固定的和/或石蜡包埋的样品（FFPE样品））。
[0007] 使用本领域中任何已知方式来制备目标核酸。作为实例，可以根据本领域中公知 的技术（见例如Sambrook等的'Maniatis'）从样品来获得基因组DNA。在获得之后，DNA 可以被片段化以便生成具有较短长度的核酸。形成的片段可具有数百、数千或数万个核苷 酸的长度数量级。在某些实施方式中，片段具有50-1000个核苷酸长度、100-1000个核苷酸 长度、200-1000个碱基对长度或300-800个碱基对长度，而它们并不限于这些长度。核酸可 以通过任何方式片段化，包括但不限于机械、酶促或化学方式。实例包括剪切、超声处理、雾 化和核酸内切酶（例如，脱氧核糖核酸酶I)消化或者本领域中已知的任何其他技术，以便 产生核酸片段（优选地具有期望长度的片段）。片段化之后可以是大小选择技术，用于将具 体长度的片段富集或分离。这种技术在本领域中也是已知的，并且包括但不限于凝胶电泳 或 SPRI。
[0008] 可选地，可以使用已经具有期望长度的目标核酸。这种目标核酸包括来源于外显 子富集方法的那些核酸，对于在测序之前分离和/或富集序列（例如外显子）的方法，参见 Albert 等 Nat Meth 4(11) :903-905 (2007)、Porreca 等 Nat Meth 4(11) :931-936(2007)、 Okou等Nat Meth 4(11) :907-909(2007)。因此，除了片段化（随机地或非随机地）较长的 目标核酸，目标可以是天然存在的或可被以较短的可用长度分离的核酸，例如mRNA、cDNA、 外显子、PCR产物（如上面描述的）等。
[0009] 通常，目标核酸在5'和3'端中的一端或两端连到序列。这些接头序列包括测序 引物位点（即，测序引物将杂交到的位点），所述测序引物位点将被用于本发明的测序方法 中。
[0010] 在某些实施方式中，如下面论述的，进行扩增的目标具有相同或类似长度（例如， 目标之间5-10%的变化）。在某些实施方式中，这种变化可以保持得尽可能小，以便确保均 匀地施加所有模板。
[0011] 扩增的产物能够以多种方式固定到支持物表面（例如，玻璃表面）。例如，扩增方 法可以在溶液中执行并且最终产品随后连接到支持物表面。扩增产品可以在其5'端或其 3'端连接到支持物固体支持物。可以通过杂交连接到核酸（所述核酸被固定到支持物表 面），或者可以通过扩增产品的末端的部分的相互作用与支持物表面上的部分连接。实例包 括：使用生物素或双生物素标记的DNA(Margulies等Nature 437:376(2005))与链霉亲和 素/抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白包被的支持物表面、DIG (地高辛）和抗DIG抗体或 抗体片段、荧光素和抗荧光素抗体或抗体片段（Gore等Nature 442, 836-9 (2006))，或者通 过使用杂官能交联剂，例如生物素化琥珀酰亚胺基丙酸酯-PEG，所述杂官能交联剂可被例 如偶联到胺官能化玻璃并且用于通过链霉亲和素夹心（即，核酸生物素链霉亲和素/抗生 素蛋白/中性抗生素蛋白-生物素固体支持物相互作用）来固定化生物素标记的DNA。
[0012] 模板可被提及为随机固定到表面上。这意味着模板不是基于序列置于固体支持物 表面上。然而，它们以确保每个模板都被一个区域（并且因此所述体积）环绕的方式置于 固体支持物上，在聚合酶介导的掺入反应和/或在模板的延伸期间所述区域将不会被另一 个模板占据。也就是说，在一些情况下，模板彼此以足够距离定位在表面上以便防止模板之 间的任何相互作用。
[0013] 固体支持物是指模板结合或固定的元件，其可包括任意材料，然而，只要所述材料 对于模板、引物、聚合酶、dNTP和在测序反应和清洗中使用的其他组分来说相对惰性，所述 材料包括但不限于玻璃或其他硅基材料、塑料或其他聚合物基材料。固体支持物可以是或 者可以不是刚性的。它可以是多孔的。它可以是或者可以不是连续的。在某些实施方式中， 固体支持物是载玻片。在某些实施方式中，支持物是自身固定到固体支持物上的多个珠子 或颗粒（例如微粒）。这种珠子可以是多孔的。支持物可以是筛网。在某些实施方式中，固 体支持物本身是探测器或传感器，例如但不限于接触成像器。
[0014] 应当理解的是，只要多个成员中的每个都与其他成员充分地间隔开以使得模板之 间没有发生重叠，那么多个模板（无论相同或者不同）可被拴连到固体支持物。
[0015] 通常，模板必须在其自由末端连接到可观察（或可检测）的部分。这种部分意在 代表模板的自由末端，并且因此其位置和沿着力的方向上的移动指示模板的长度。可观察 部分可以是任何数量的部分并且本发明不限于其性质。可观察部分的性质将决定适于观察 (或者检测或监测）模板长度的传感器或检测器的类型。在某些重要实施方式中，可观察部 分是珠，例如微珠并且甚至更具体地例如磁珠。
[0016] 部分可以通过多种方法连接到模板，并且采用多种相互作用，包括但不限于非共 价相互作用，例如生物素/链霉亲和素、DIG/抗DIG和荧光素/抗荧光素结合对以及共价 相互作用，例如本文关于模板（或引物）共价固定到支持物表面所讨论的那些。
[0017] 固体支持物是流通池的一部分或者邻近流通池。如本文使用的，流通池是腔室，所 述腔室具有流体流动通过的至少一个进入端口和至少一个排出端口。取决于用于观察模板 的检测系统的位置，模板拴连到其上的固体支持物可以在流通池下方、上方或旁边。固体支 持物可以是流通池的壁，包括底部壁、侧壁或顶壁。
[0018] 应当理解的是，模板的准确和快速测序取决于未掺入的核苷酸从系统去除的程度 和速率。因此，快速和完全（或几乎完全）去除未掺入的核苷酸是重要的。微流体系统必 须还被设计成使清洗最大化，从而潜在地导致更小的清洗体积和清洗持续时间。
[0019] 还可通过三磷酸腺苷双磷酸酶部分或完全的使用来促进未掺入的核苷酸的清除， 所述三磷酸腺苷双磷酸酶降解未掺入的dNTP并且使它们不适于进一步的掺入。三磷酸腺 苷双磷酸酶可以自由流动，添加到清洗缓冲液，并且一旦任何给定核苷酸三磷酸盐类型的 掺入（如通过可检测部分在模板的端部处的任何上述背景运动的中断所指示）停止就导入 流通池中。可选地或另外地，三磷酸腺苷双磷酸酶可以固定或固定化在流通池内，例如固定 或固定化到固体支持物表面（模板也固定或固定化到所述固体支持物表面）。这可以通过 使用接头形成，以便使酶更易获取并且去除关于非常接近表面的任何位阻。三磷酸腺苷双 磷酸酶可以连接到长度不同的多种接头。以此方式，三磷酸腺苷双磷酸酶可以存在于流通 池内的多种流动流中，所述多种流动流包括那些更接近于壁的流动流和那些更接近于或位 于中心流动流的流动流。如上面论述的，接近壁的流动流（它低速流动）和在这些流动流 中存在的未掺入dNTP不大可能被清除。这些流动流中具有三磷酸腺苷双磷酸酶应当改善 这些dNTP的去除。这将增加模板长度改变是新引入到流通池中的dNTP(而非在清洗之后 剩余在流通池中的残留和未掺入的dNTP)掺入的结果的可能性。
[0020] 在本发明的某些方面中，测序方法被称为合成测序反应。这意味着，确定第一核酸 的序列需要使用第一核酸作为模板来合成第二核酸。以此方式，通过未掺入dNTP的顺序和 数量确定第二核酸的序列，并且第一核酸的序列确定为第一核酸序列的互补序列。本发明 的方法通过改变模板的长度而不是通过直接观察dNTP添加到