由木质纤维素生物质生产寡糖的方法
【专利说明】由木质纤维素生物质生产寡糖的方法
[0001]本发明涉及由木质纤维素生物质生产寡糖的方法。本发明还涉及生产纤维素酶的方法，其包含用于生产由木质纤维素生物质合成的寡糖的单元。最后，本发明涉及由木质纤维素生物质生产糖和醇、溶剂或有机酸并包括用于原位生产寡糖和纤维素酶的单元的被称作“第二代”方法的方法。
现有技术
[0002]为了满足能源转型的挑战，特别是为了降低运输模式对环境的影响和它们对油的依赖，正在进行许多研究以利用和优化可再生生物资源，如木质纤维素生物质。
[0003]木质纤维素生物质代表地球上最丰富的可再生资源之一。考虑中的基材差异很大，因为它们涉及木质基材(硬木和软木)、农业副产品(稻草)和来自生成木质纤维素废料的工业(农业食品(agroalimentary)工业、造纸工业)的那些。
[0004]木质纤维素生物质由三种主要成分构成:纤维素(35%至50%)、半纤维素(23%至32%)(其是基本由戊糖和己糖构成的多糖)和木质素(15%至25%)(其是具有复杂结构和源自苯基丙稀醇(phenylpropenoic alcohols)的共聚的高分子量的大分子)。这些各种分子对植物壁的固有性质负责并组织成复杂的基质。
[0005]在这种生物质中占多数的纤维素因此是地球上最丰富的聚合物并具有用于形成材料和生物燃料的最大潜力。但是，主要由于纤维素的提取困难，迄今尚未充分开发纤维素及其衍生物的潜力。实际上，植物本身的结构使这一步骤困难。关于纤维素的提取和转化，已确认的主要技术障碍是其可及性、其结晶度、其聚合程度以及半纤维素和木质素的存在。
[0006]使用生物技术工艺转化木质纤维素生物质的方法的原理使用了酶法水解植物材料中所含的纤维素以产生葡萄糖的步骤。所得葡萄糖随后可以发酵成各种产物，如醇(乙醇、1，3-丙二醇、1-丁醇、1，4-丁二醇等)或酸(乙酸、乳酸、3-羟基丙酸、富马酸、琥珀酸等)。
[0007]纤维素和可能半纤维素是酶法水解的靶标，但酶无法直接触及它们。因此，这些底物必须经过在酶法水解步骤之前的预处理。该预处理旨在改变木质纤维素材料的物理和物理化学性质以改进对截留在木质素和半纤维素基质中的纤维素的可及性。
[0008]水解是一种困难的操作，其通常涉及酶型水解。实际上推荐后者，因为其与化学型水解(例如酸水解)相比生成极少的待加工流出物。
[0009]目前，这种类型的水解在由微生物，如细菌或真菌(凝藤、#藥属、术藥属)产生的纤维素酶存在下进行。这些微生物产生以协同方式作用以将纤维素水解成单体葡萄糖以及可能半纤维素的酶混合物。在存在的酶系中特别强调的是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡糖苷酶。其中，里氏木霉(Trichoderma reesei)是最有希望的物种，因为其能够分泌大量的高活性纤维素酶。
[0010]但是，生产纤维素酶的成本仍然高并代表以工业规模实施这种类型的方法的经济障碍之一。
[0011]在工业上，在使用含有乳糖作为诱导纤维素酶生成的糖的进料溶液的分批补料程序(进料但无排料(infeed without withdrawal))中进行通过里氏木霉生成纤维素酶的最优化生产(FR 2 555 603)。但是，独自使用的乳糖太昂贵以致无法低成本生产纤维素酶。
[0012]为了降低与购买乳糖有关的成本，可以考虑将所有或一部分乳糖诱导部分换成另一诱导糖，其:
?是一样好的诱导剂但更便宜
?或是更昂贵但更好的诱导剂，这意味着可以进一步降低用于分批补料程序的进料溶液中的诱导剂的最低量。
[0013]因此，例如，纤维二糖(β (1 — 4)葡萄糖二聚体)是用于生成里氏木霉中的纤维素酶的天然诱导剂。纤维二糖是纤维素水解成葡萄糖(这被酶葡糖苷酶催化)中的最后一种中间体。为了产生纤维二糖，可以考虑使用不含葡糖苷酶的纤维素酶混合物以将纤维素水解成纤维二糖。但是，这种反应的动力学缓慢，因为纤维二糖极强地抑制纤维素酶(纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)。此外，这一选项要求单独生产不含葡糖苷酶的特定混合物，这使工业利润较低。
[0014]另一替代方案可能包括使用槐糖(β(1 — 2)葡萄糖二聚体)，其已知是更强的诱导剂，但其成本仍抑制工业使用。
[0015]因此，本发明的一个目的是提出从运行成本的角度看优化的生产糖、纤维素酶和醇和/或溶剂的方法，其特别由木质纤维素生物质起始。
[0016]发明概述
第一方面，本发明提出由木质纤维素生物质生产寡糖的方法，其包括至少下列步骤:
a)在预处理反应器中预处理生物质以提供包含预处理过的底物的流出物；
b)在反应器中在纤维素酶存在下进行获自步骤a)的流出物中所含的预处理过的底物的酶法水解以产生含有葡萄糖、纤维素酶和水的水解产物；
c)取出包含液体部分的至少一部分获自步骤b)的水解产物；
d)降低步骤c)中取出的所述部分的水解产物的水含量以使所述水解产物的液体部分的水含量为所述水解产物的液体部分的总重量的小于65重量％水；
e)将获自步骤d)的水解产物在40°C至70°C的温度下孵育产生富含寡糖的流出物所需的时间。
[0017]本发明的寡糖生产方法使用木质纤维素生物质作为起始材料，其易得，也便宜。
[0018]本发明人已经观察到，当所述水解产物的液体部分的水含量为所述水解产物的液体部分的总重量的小于或等于65重量％时，可以促进由含有葡萄糖和纤维素酶的水解产物起始通过孵育形成寡糖。
[0019]优选地，所孵育的获自水解步骤的水解产物具有至少1 IU/mL，优选至少5 IU/mL的β-葡糖苷酶活性。在50°C下孵育30分钟的同时，在50mM柠檬酸盐缓冲液中在4.75 pH下使用5mM pNPG (对-硝基酚_β -吡喃葡萄糖)作为底物测量这种β -葡糖苷酶活性[Dashtban, Maki, Leung, Mao 和 Qin (2010) Cellulase activities inb1mass convers1n: Measurement Methods and Comparison.Critical Reviews inB1technology 30 (4)第302-309页]。接着，通过吸光度测量pNPG被β -葡糖苷酶水解产生的对硝基酚的浓度。葡糖苷酶活性以IU/mL表示，其中IU代表ymol/min (每分钟反应释放的产物的μπιο?数)。
[0020]根据一个实施方案，通过在低于90°C的温度下蒸发，进行降低水解产物的液体部分的水含量的步骤d)。
[0021]根据另一实施方案，通过将葡萄糖添加到步骤c)中取出的水解产物中，进行降低水解产物的液体部分的水含量的步骤d)。
[0022]或者，在步骤d)中，将步骤c)中取出的水解产物分离成至少第一部分和第二部分，第一部分的水解产物在大于90°C的温度下浓缩以获得浓缩水解产物部分，并将该浓缩水解产物与第二、未浓缩的水解产物部分混合。
[0023]根据另一实施方案，在步骤d)中，例如通过反渗透或通过纳滤进行步骤c)中取出的水解产物的膜分离以回收具有降低的水含量的水解产物和水溶液。
[0024]在根据本发明的生产寡糖的方法的情况下，也可以进行获自步骤a)的流出物的固/液分离以回收含有糖的液体部分和送往步骤b)的含有预处理过的底物的固体部分。关于该液体部分，这可以作为与水解产物的混合物在步骤d)中处理，或与获自步骤e)的富含寡糖的流出物混合。
[0025]优选地，在孵育步骤e)结束时，获得包含选自槐糖和龙胆二糖(单独或作为混合物)的寡糖的流出物。
[0026]根据本发明的生产寡糖的方法本身可并入到生产醇和/或溶剂的现有单元中，被称作第二代，其使用木质纤维素生物质作为起始材料。
[0027]因此，本发明还涉及由木质纤维素生物质起始生产纤维素酶的方法，其包括至少下列步骤:
a)在预处理反应器中预处理生物质以提供包含预处理过的底物的流出物；
b)在反应器中在纤维素酶存在下进行获自步骤a)的流出物中所含的预处理过的底物的酶法水解以产生含有葡萄糖、纤维素酶和水的水解