基因表达生物标志物及其用于潜在需要hdac抑制剂治疗的患者中的诊断和预后应用的用图
【专利说明】基因表达生物标志物及其用于潜在需要HDAC抑制剂治疗 的患者中的诊断和预后应用的用途
[0001] 本发明针对可与HDAC抑制剂治疗结合使用的某些特定生物标志物、其中应用所 述生物标志物的方法、以及供所述方法使用的试剂盒。
[0002] 发明背景
[0003] 对由非基本DNA序列变化的机制所致的表型（表观）或基因表达的可遗传变化的 研究被称为表观遗传学。可能的是此类变化通过细胞分裂仍存在于剩余的细胞生命中，并 且可以存在多代。所述非遗传因素使得生物体的基因以不同方式表现或表达它们自己（菲 利普亨特（Philip Hunter)的专题报告："基因记住什么"（Special report: "What genes remember"），展望杂志（Prospect Magazine)，2008 年 5 月，146 期）〇
[0004] 最近的表观遗传学探究已显示环境因素影响生物体的特征并且可有时被传递到 后代。迄今科学表明，涉及分子结构的那些重要因素为染色体的结构组分、组蛋白、为了以 有序且紧凑的方式储存DNA而用于DNA的一种包装物。取决于它们所携带的化学基团和相 应的修饰，例如如果它们被乙酰化、磷酸化或甲基化，那么它们永久地激活基因或使基因失 活。
[0005] 作为整体，在各种各样的生物体（包括原核生物、植物和动物）中已报告了多于 100个跨代表观遗传改变实例（阿波龙卡伊娃（ablonka，Eva);加尔拉斯（Gal Raz)，2009， 生物学评论季刊（Quarterly Review of Biology) ,84 (2) :131 - 176) 〇
[0006] 表观遗传机制的分子基础是复杂且多样化的，并且涉及某些基因的激活状态的改 变，但非DNA的基本结构和序列的改变。此外，与DNA相关的染色质蛋白可处于由多种蛋 白质修饰诱导的激活或沉默状态。如以上提及的，当细胞分化时也保留了例如染色质的此 类表观遗传变化。基于这些修饰，围绕组蛋白缠绕的DNA的方式被改变，并且由于此结构修 饰，基因表达也被改变。染色质重建的此类机制可通过若干机制完成。
[0007] -个重要过程包括组成组蛋白的氨基酸的翻译后修饰，这可能发生为例如乙酰 化、甲基化和/或磷酸化。如果氨基酸被修饰，那么组蛋白的总体形状可能被改变。而且， 在复制过程中DNA不完全解绕，因此，似乎可能的是此类修饰的组蛋白可被携带到DNA的每 个新拷贝中。然后这些修饰的组蛋白可作为模板结构，使得周围的新组蛋白也以修饰的方 式成形。
[0008] 具体地组蛋白的非结构化的N端（也称为"组蛋白尾"）被高度修饰，但是组蛋白 修饰可在整个序列上发生。这些修饰包括乙酰化、甲基化、遍在蛋白化、磷酸化以及苏素化。 例如，通过组蛋白乙酰转移酶（HAT)进行的组蛋白H3尾的K14和K9赖氨酸的乙酰化通常 与转录能力相关。因此脱乙酰作用与转录沉默相关并且通过具有组蛋白脱乙酰酶（HDAC) 活性的酶服务来发生。
[0009] 据认为乙酰化与"激活的"转录相关联的倾向在本质上是生物物理学的。因为赖氨 酸残基通常在其末端具有带正电的氮，并且因此可以缔合到DNA主链的带负电的磷酸根。 相比之下，一旦乙酰化事件改变赖氨酸侧链上的这个带正电的胺基，所述胺基就转化成中 性酰胺键中，从而使得DNA从组蛋白松解。发生这种情况时，转录因子和复合体能够更容易 地结合DNA，并且使得转录过程发生。这可被称为表观遗传机制的"顺式"模型，其中组蛋白 尾的变化对DNA本身具有直接影响。在表观遗传机制的另一种模型即"反式"模型中，组蛋 白尾的变化对DNA起间接作用。例如，赖氨酸乙酰化可产生用于染色质修饰酶（以及基本 转录机器）的结合位点，这然后使染色质状态变化。实际上，在许多酶中发现保守的布罗莫 结构域，即特异性结合乙酰基-赖氨酸的蛋白质区段（结构域），帮助激活转录，包括SWI/ SNF复合体（在蛋白质多同源调节域蛋白上）。总之，似乎是乙酰化以"顺式"和"反式"两 种模型起作用，以修饰转录激活。
[0010] 据信不同的组蛋白修饰以不同的方式起作用；在一个位置处的乙酰化有可能以不 同于另一个位置处的乙酰化的方式起作用。而且，可发生多次修饰，并且这些修饰可一起作 用以改变核小体结构（DNA和组蛋白）的行为。对组蛋白的这些基本多次动态修饰以系统 性且可再现的方式调控基因转录，并且称之为组蛋白密码。
[0011] 调节表观遗传机制有希望用于多种潜在的医疗应用。先天性遗传病被很好地理 解，但也清楚的是表观遗传学就例如安格曼综合征和普瑞德-威利氏综合征而论是重要 的。这些是由基因缺失或基因失活导致的正常遗传病，但它们异乎寻常地常见是因为由于 基因组印记，受影响的个体实质上是半合子的，并且因此单个基因敲除足以导致所述疾病， 其中大多数情况将需要敲除两个拷贝（在线"人类孟德尔遗传学（Mendelian Inheritance in Man) '，，OMIM，www. ncbi. nlm. nih. gov/omim) 〇
[0012] 尽管一般认为多细胞生物体中的表观遗传机制参与分化，但在不同物种中观察到 一些多代表观遗传改变。这些多代表观遗传性状中的大多数经过若干代后可以逐渐丧失， 但仍然有可能的是多代表观遗传改变可以为进化与适应添加另一个方面。与DNA区相关 联的表观遗传特征的修饰使得生物体在多代时间范围上在表达和抑制所述特定基因的表 型之间转换（O.J.兰多（O.J.Rando)和K.J.韦斯特里彭（K.J.Verstr印en)，2007,细胞 (Cell) 128 (4) : 655 - 668)。当所述区的DNA序列未突变时，这个变化是可逆的并且为适应 过程提供灵活性。
[0013] 当前研究表明，表观遗传药物制剂可以是用于目前通用的治疗方法如辐射和化疗 的公认的代替或辅助疗法，或者能够增强这些目前治疗的效果（Wang，LG ;Chiao, JW，2010， 国际肿瘤学杂志（Int.J.0nc〇l〇.)3(37) :533 - 9)。已表明通过组蛋白的构象变化实 现的对例如原癌基因区和对肿瘤抑制基因序列的表观遗传控制直接影响癌症的形成 和进展（伊格莱夏斯-利纳雷斯（Iglesias-Linares)等人，2010，口腔肿瘤学（Oral Oncology)5(46):323 - 9)。
[0014] 此类使用表观遗传学上起作用的药物的新治疗方案提供了可逆性的机 会，这是其他癌症治疗未能提供特征（李0^)，^:;卡罗尔1?化 &^〇11，？1?);达希亚 R(Dahiya，R)，2005. JNCI 2 (97) :103 - 15)。迄今，表观遗传药物开发主要集中于组蛋白 乙酰转移酶（HAT)和组蛋白脱酰酶（HDAC)，包括向市场引进新的HDAC抑制药物伏立诺他 (vorinostat)和罗米地辛（omidepsin)(斯潘诺夫 A(Spannhoff，A);斯皮尔 W(Sippl，W); 荣格M(Jung，Μ) (2009)，生物化学与细胞生物学国际期刊1(41) :4- 11)。特定地HDAC酶已 显示在口腔鳞状细胞癌的进展中起到重要作用（伊格莱夏斯-利纳雷斯等人，（2010)，口 腔肿瘤学5(46) :323 - 9)。近来已将选择HDAC同工酶的过量表达与不同癌症类型的恶化 预后关联，如肝癌和其他癌症中的HDAC-I和HDAC-2(李TK (Lee TK)、波赫YP (Poh YP)等 人，2011:临床研究杂志（The Journal of Clinical Investigation),网上公布于 2011 年2月，www. jci.org)或结肠直肠癌中的HDAC-2(朱（Zhu) P、马丁 E (Martin E)、蒙瓦塞尔 J (Mengwasser J)、施拉格 P (Schlag P)、扬森 KP (Janssen KP)、Gdtt丨icherM·, 2004,癌细 胞（Cancer Cell.) 2004年5月；5 (5) :455-63)。如上所述，异常HDAC酶表达或活性被认为 是与多种人恶性肿瘤相关联，这致使众所周知的肿瘤抑制基因阻抑并且改变对恶性肿瘤进 展重要的其他因子的活性。因此，组蛋白脱乙酰酶的抑制代表了在肿瘤学药物开发中有希 望的治疗概念。
[0015] 今天，实际上广泛接受的是，不仅基因组成（即DNA的直接碱基序列，和/或个体 的基因的突变）造成各种疾病（特别是癌症）发病，而是此外，例如影响表观遗传二次包装 成染色质的环境信号的影响也可以影响或造成致病事件，促使癌发生。
[0016] 上述表观遗传变化甚至可能从一个细胞子代向前传到另一个细胞子代，或者一般 甚至可以传递到后代，因此提供了具有遗传和表观遗传组成的个体。
[0017] 因此，应注意，不仅仅是基因组成或基因中的突变，而且个体的整体表观遗传组成 可以造成疾病的发展，并且可以有助于身体对影响这种表观遗传机制的药物的反应。这样， 观察由影响表观遗传机制的药物诱导的身体的任何细胞中个体表观遗传组成的变化可以 呈现用以预测个体对治疗的反应的有效方法。这种个体的患病组织有可能响应于对表观遗 传水平起作用的药物，其方式为与其中这种药物效应可测量的非患病组织相同或类似。
[0018] 此类药物例如表现为具有组蛋白脱乙酰酶活性的酶的抑制剂，或者现在一般称为 蛋白脱乙酰酶，因为它们的脱乙酰活性常常不限于以组蛋白作为客户蛋白，并且可能更广 泛地直接或间接地影响原癌基因和肿瘤抑制蛋白功能。
[0019] 各种HDAC抑制剂目前正经受在广泛的肿瘤实体（包括恶性血液病和实体瘤）中 的临床研究，并且代表了一类具表观遗传活性的、有效的抗增殖、分化诱导和促凋亡剂。组 蛋白脱乙酰酶抑制剂家族的两名成员（伏立诺他和罗米地辛）已经被批准用于治疗难治性 皮肤T细胞淋巴瘤，在这些患者中它们表现出与单一治疗剂相当的临床益处。
[0020] 多种另外的HDAC抑制剂现在处于不同阶段的临床开发中，包括帕比司 他（panobinostat)、恩替诺特（entinostat)、贝林司他（belinostat)、吉维司他 (Givinostat)以及瑞米司他（resminostat)(马克斯 PA (Marks, PA)和 Wu, W-S, 2009， 细胞生物化学杂志（J· Cell. Biochem.) ;107 (4) :600-608)(埃利斯 L(Ellis，L)和皮利 R(Pili，R)，2010,药物制剂（Pharmaceuticals)(Basel) ;3(8) ;2411-2469)〇
[0021] 然而，在本领域中需要在治疗意向或过程中尽早确定HDAC抑制剂治疗的效果。
[0022] ZFP64为C2H2型锌指蛋白（ZFP)家族的转录因子，它在许多细胞功能，包括发育、 分化、肿瘤发生以及免疫反应中起重要作用。它是TLR信号传导与NF- κ B激活以及后续炎 症反应以侵入病原体的正调节蛋白（Wang等人，生物化学杂志（J Biol Chem) 2013,网上公 布于年2013年7月15日）。然而，其生物学功能大部分仍是未知的。
[0023] 基于 IHC 染色实验（参见 http://www. proteinatlas. org/ENSG00000020256/ tissue/staining+overview)，ZFP64蛋白优选在某些组织/器官中表达并且主要出现在核 中。正常组织/器官中的ZFP64蛋白优选表达于：肝、胰腺和胃肠道，以及睾丸和皮肤。癌 组织中的ZFP64蛋白优选在以下癌症类型中表达：肝癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌以及肾 癌。相比CRC患者的原发性肿瘤，ZFP64在肝转移中是上调的（李（Li)等人，肝胆胰腺病 杂志（Hepatobiliary Pancreat Dis Int. )2010 ;9:149_53) ο
[0024] 已确定ZFP64通过Notchl的共激活来调控间充质细胞的分化。据报告ZFP64关 联到Notchl的胞内结构域（NICD)上，并且被募集至Notch革El基因 Hesl和Heyl的启动 子，并且反式激活所述启动子，并且参与Notchl的共激活所致的间充质细胞分化（坂本 (Sakamoto)等人，细胞科学杂志（J Cell Sci. )2008 年 5 月 15 H;121(PtlO):1613-23. doi:10.1242/jcs. 023119)〇
[0025] 发明概述
[0026] 在临床前和临床研究中确定的是，HDAC抑制剂的使用引起特定基因表达模式的可 再现调节。可以看出，HDAC抑制剂在以下各项中以相同方式调控这些基因表达：（i)在各 种各样用HDAC抑制剂体外处理的不同癌症细胞类型中，以及（ii)在临床研究背景下在用 HDAC抑制剂处理的癌症患者的外周血细胞中，以及（iii)在用HDAC抑制剂活体外处理的健 康供体的PBMC中。
[0027] 因此可以推断，给定患者的癌细胞和外周血细胞的总体表观遗传组成在其对某些 药理学试剂如HDAC抑制剂的影响的易感性方面是相当的，并且因此这两种细胞类型将经 历相同或类似的基因表达调节。因此，在患者的外周血细胞中表观遗传学上诱导的某些特 定基因的基因表达变化可以潜在地用于确定相同患者的肿瘤细胞的药物活性。
[0028] 此外，在用HDAC抑制剂治疗患者的过程中基因表达谱的这些表观遗传学上诱导 的变化的增加或减少可以指示对于患者的降低的或增加的治疗益处，并且因此可以与疾病 预后相关联。
[0029] 发明简要说明
[0030] 在一个方面，本发明涉及癌细胞系和PBMC中以及癌症患者的外周血细胞中的特 定选择的基因的基因表达的调节，所述基因在暴露于HDAC抑制剂后可再现地变化。
[0031] 所预期的是这些基因表达调节（在此也称为生物标志物）具有各种效用。
[0032] 它们可以充当所用HDAC抑制剂的药效动力学活性的标志物。
[0033] 在参与HDAC抑制剂治疗之前它们可以充当预测性生物标志物（或用于分级），从 而允许预测患者是否应该用HDAC抑制剂治疗或在有待用HDAC抑制剂治疗的患者中是否可 能出现或不出现临床益处。
[0034] 在参与HDAC抑制剂治疗之前它们可以充当预后性生物标志物，从而允许预测对 于给定患者疾病将如何进展，这无关治疗。
[0035] 在HDAC抑制剂治疗过程中它们可以充当生物标志物，以便预测患者可以从所述 HDAC抑制剂治疗中获益的时间，并且总体上监测所述HDAC抑制剂治疗的进展。
[0036] 此外，这些生物标志物因此还可以参与疾病进展，并且由此本身可以表示治疗靶 标结构。因此，可以利用各种手段使它们的活性经受治疗干扰，如通过例如SiRNA干扰影响 它们的mRNA表达图式；通过基因治疗来增加它们的存在；利用抗体技术来调节他们的蛋白 质功能，或利用小分子结合物来改变此类生物标志物实体的功能效力。同样疫苗接种方法 也是可能的。
[0037] 因此本发明的主题是至少一个基因、所述至少一个基因的DNA序列、由所述至少 一个基因或其长至少150 (优选180)个核苷酸的片段编码的RNA序列、或由所述至少一个 基因编码的至少一种蛋白质或所述蛋白质的结构域在涉及HDAC抑制剂治疗的诊断和预后 方法中以及用于监测HDAC抑制剂治疗或用于对患者分级的用途，其中所述至少一个基因 选自包含以下各项的组中的一个或多个成员：2??64、0??3、00^43、!113了2!144/8、^^1^02以 及MICALL1。本发明的另外的实施例是上述至少一个基因、DNA序列、RNA序列或蛋白质分 别地作为治疗干扰的靶标的用途。
[0038] 本发明涵盖根据本发明的生物标志物、核苷酸序列、蛋白质、试剂盒、方法和用途 用于监测HDAC抑制剂治疗以及用于将潜在需要所述治疗的患者分级为反应者或非反应者 的用途。
[0039] 为本发明选择的基因的鉴定在表1中给出。
[0040] 表1 :本发明的生物标志物，通过NCBI号码、基因名称和Entrez ID标示
[0043] 实施方式详沐
[0044] 本发明的一个主题是测量根据本发明的基因中的一个或多个的基因表达，或是直 接在患病组织或在外周血细胞中进行，或是在用HDAC抑制剂开始治疗之前或在治疗过程 中进行。此外，本发明的另一个主题是比较治疗开始之前的基因表达和治疗过程中观察到 的基因表达，测量本发明选择的基因中的一个或多个的这些表达谱中的变化。此外，本发明 的另一个主题是比较接收治疗的患者的不同亚组之间的基因表达，测量本发明选择的基因 中的一个或多个的这些表达谱中的差异。
[0045] 本发明的某些实施例在以下列出。
[0046] 1. -种测定HDAC抑制剂治疗的效果的方法，所述方法包括以下步骤：
[0047] a)提供接收所述HDAC抑制剂治疗的患者的样品，
[0048] b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达和/或基 因表达变化：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2 以及 MICALL1，
[0049] c)将所测定的所述至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化与所述患者中 所述HDAC抑制剂治疗的效果相关联。
[0050] 在本发明的某些实施例中，所测定的所述至少一个基因的基因表达和/或基因表 达变化与患者中HDAC抑制剂治疗的相关性可以通过将所述测定的基因表达和/或基因表 达变化与从其他患者中获取的现有数据进行比较来测定，所述现有数据中所述至少一个基 因的某些基因表达和/或基因表达变化已被寻址到所述HDAC抑制剂治疗的效果。这种数 据可以例如以表格或机器可读数据库的形式提供。
[0051] 2. -种监测HDAC抑制剂治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
[0052] a)提供接收所述HDAC抑制剂治疗的患者的样品，
[0053] b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达和/或基 因表达变化：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2 以及 MICALL1，
[0054] c)重复以上步骤a和b至少一次，优选地多于一次，并且
[0055] d)使用步骤a)至c)中测定的所述基因表达来生成所述患者对所述HDAC抑制剂 治疗的反应的时间谱。
[0056] 根据本发明的监测HDAC抑制剂治疗的方法可以包括将所测定的所述至少一个基 因的基因表达和/或基因表达变化与所述患者中所述HDAC抑制剂治疗的效果相关联。
[0057] 3.根据以上项目1或2中任一项所述的方法，其中将所述至少一个基因的基因表 达和/或基因表达变化另外与HDAC抑制剂治疗的阳性结果或阴性结果的概率相关联。
[0058] 4. -种对潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者分级的方法，所述方法包括以下步骤： [0059] a)提供所述患者的样品
[0060] b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达：ZFP64、 DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2 以及 MICALL1
[0061] C)将所测定的所述至少一个基因的基因表达与HDAC抑制剂治疗对所述患者具有 有益效果的概率相关联，并且
[0062] d)基于步骤c中测定的概率，将所述患者分类为对所述HDAC抑制剂治疗的反应者 或非反应者。
[0063] 5.根据以上项目4所述的方法，其中在将HDAC抑制剂给予所述患者之前提供步骤 a)中提供的所述样品，
[0064] 其中在步骤a)之后，将HDAC抑制剂活体外添加至所述样品中以抑制所述样品中 的HDAC，并且
[0065] 其中在步骤b)中，在包含所述HDAC抑制剂的所述样品中测定至少一个基因的基 因表达。
[0066] 具体地讲，在以上项目5中，表述"在将HDAC抑制剂给予所述患者之前提供步骤 a)中提供的样品"意思是在第一次将HDAC抑制剂给予所述患者之前提供步骤a)中提供的 所述样品。可替代地，在以上项目5中，表述"在将HDAC抑制剂给予所述患者之前提供步骤 a)中提供的样品"意思是在第一次将特异性HDAC抑制剂（例如，瑞米司他（resminostat)) 给予所述患者之前提供步骤a)中提供的所述样品，所述特异性HDAC抑制剂预期给予所述 患者以用于HDAC抑制剂治疗。
[0067] 在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的(XDC43的基因 表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25%或更多，优选50%或更多，更 优选75 %或更多，甚至更优选100 %或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中所 述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受试 者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
[0068] 在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的DPP3的基因表 达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25%或更多，优选50%或更多，更优 选75 %或更多，甚至更优选100 %或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述 基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受试者 中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
[0069] 在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的HIST2H4A/B的 基因表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25%或更多，优选50%或更 多，更优选75%或更多，甚至更优选100%或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试 者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健 康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
[0070] 在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的KDELC2的基因 表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25%或更多，优选50%或更多，更 优选75 %或更多，甚至更优选100 %或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中所 述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受试 者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
[0071] 在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的MICALL1的基 因表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25 %或更多，优选50 %或更多， 更优选75 %或更多，甚至更优选100 %或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中 所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受 试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
[0072] 在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的ZFP64的基因 表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25%或更多，优选50%或更多，更 优选75 %或更多，甚至更优选100 %或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中所 述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受试 者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
[0073] 6. -种预测针对接收HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果 的概率的方法，所述方法包括以下步骤：
[0074] a)提供所述患者的样品
[0075] b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达：ZFP64、 DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2 以及 MICALL1，
[0076] c)将所述基因表达与在步骤a)之前从所述患者提供