大黄素衍生物及其在制备抗hiv-1药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大黄素衍生物及其在制备用于治疗HIV-ι药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 人类免疫缺陷病毒（HIV)是艾滋病（AIDS)的病原体。自AIDS流行以来，全世界 累计有7500万HIV感染者，我国亦有将近75万人感染HIV，2014年新报告感染者和病人达 10. 4万例，较上年增加14. 8%。然而，目前世界上还没有任何一个地区解决了艾滋病的治 疗问题，HIV感染者人数将会持续增长。
[0003]目前有十几种抗艾滋病病毒药经批准用于治疗艾滋病。国际公认的治疗方法是 "鸡尾酒"或称高效抗逆转录病毒疗法（即2种逆转录酶抑制剂+1种蛋白酶抑制剂），这种 疗法可以显著降低感染者和艾滋病患者血浆病毒载量，延长生存时间，改善生活质量。但 尚存在一些问题，如停药后病毒载量反弹、不能恢复免疫功能、容易出现耐药性、价格昂贵 (人年均费用约8万元）、由于严重的毒副作用不能长期坚持用药等。为了解决艾滋病治疗 中存在的问题，可以采取的途径有两种，一种是发展新的有效、低毒、价廉的药物，另一种是 探索新的治疗方法。多年来，我们在第一种途径，即发展新药研制方面进行了大量实验室筛 选，发现了一些具有抗病毒活性的中草药及提取物，并在实验动物中也证明了其抗病毒作 用，这其中就包含有大黄来源的大黄素。
[0004] 大黄属寥科植物，性味苦寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经。具有泻下攻积、清热泻火、 解毒、止血、活血祛淤等多种功效。现代药理研究发现，大黄有抗肿瘤、抗菌消炎、抗动脉硬 化、降血压、泻下利尿、保肝利胆、清除自由基等多种作用；同时还有抗流感病毒、乙型肝炎 病毒、单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒、风疹病毒等作用。我们前期实验结果也显示，中药大黄提 取物中大黄素能通过上调CC-趋化因子、I型干扰素、AP0BEC3G抑制HIV-1R5毒株在人巨 噬细胞中的感染。而且有研究发现，大黄素能增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬性，促进干扰素分 泌，从而提尚小鼠免疫力。
[0005] 大黄素属于蒽醌类化合物，其发挥抗病毒作用的主要部分为蒽醌，但是大黄素溶 解性很差，几乎不溶于水，仅溶于碱和一些有机溶剂如乙醇、二甲基亚砜（DMS0)，而且稳定 性比较差，容易氧化变质。这成为大黄素临床应用开发的一大障碍。
【发明内容】
[0006] 本研究尝试在保留蒽醌的基础上，添加或者改变一些功能团，使得新蒽醌类化合 物既能够保留抗病毒的功能，又可以增加水溶性或脂溶性，具有更好的成药性，未来用于 AIDS的治疗。
[0007] 本发明的目的是提供一种经过化学修饰的大黄素衍生物，及其在用于治疗HIV-1 的药物的应用。
[0008] 本发明的大黄素衍生物为以下结构式所示：
[0009]
[0010] 式I，3-乙酸大黄素
[0011]
[0012] 式II，1，8-二己酰大黄素
[0013] 本发明所述的大黄素衍生物，是将商品化的大黄素经过化学修饰得到的化合物。
[0014] 制备本发明的大黄素衍生物的反应如以下反应式所示：
[0015] 1、3-乙酸大黄素反应式及鉴定
[0016] 反应式：
[0019] 2、1，8-二己酰大黄素反应式及鉴定
[0020] 反应式：
[0023] 通过大黄素衍生物抗HIV-1的活性测定表明，本发明的大黄素衍生物能够抑制 HIV-1在人巨噬细胞中的感染与复制。因此，可用于制备治疗HIV-1的药物。
[0024] 本发明还提供了一种用于治疗HIV-1的药物，其含有上述本发明的大黄素衍生物 以及药学上可接受的辅助剂。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂、或乳剂 的形式使用，其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉。
[0025] 大黄素衍生物3-乙酸大黄素和1，8-二己酰大黄素脂溶性和水溶性较大黄素好， 且无明显毒副作用，为临床用药提供了新的选择。
【附图说明】
[0026] 图1是3-乙酸大黄素的核磁氢谱图。
[0027] 图2是1，8-二己酰大黄素的核磁氢谱图。
[0028] 图3是3-乙酸大黄素和1，8-二己酰大黄素对人巨噬细胞的毒性作用的结果图。
[0029] 图4是3-乙酸大黄素和1，8-二己酰大黄素抑制HIV-1在人巨噬细胞中感染与复 制作用的结果图。
[0030] 图4a是HIV-1Bal毒株感染人巨噬细胞2h后，于感染后第8天收集细胞，Gag基 因mRNA表达图；
[0031] 图4b是HIV-1Bal毒株感染人巨噬细胞2h后，于感染后第8天收集细胞上清， ELISA检测细胞上清中P24蛋白表达图；
[0032] 图4c是HIV-1Bal毒株感染人巨噬细胞2h后，于感染后第8天收集细胞，蛋白印 迹法测定细胞中P24表达图；
[0033] 图4d是在光镜下观察（X200倍），大黄素、3-乙酸大黄素和1，8-二己酰大黄素 处理后，人巨噬细胞中的病毒包涵体；
[0034] 图5是3-乙酸大黄素和1，8-二己酰大黄素抗HIV-1作用的时间效应图。
[0035] 图5a是人巨噬细胞中Gag基因mRNA的水平随感染时间的变化而改变的图；
[0036] 图5b是人巨噬细胞上清中P24蛋白表达随感染时间的变化而改变的图；
[0037] 图6是3-乙酸大黄素和1，8-二己酰大黄素抗HIV-1作用的剂量效应图。
[0038] 图6a是人巨噬细胞中Gag基因mRNA的水平随药物浓度的变化而改变的图；
[0039] 图6b是人巨噬细胞上清中P24蛋白表达随药物浓度的变化而改变的图；
【具体实施方式】
[0040] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0041] 大黄素是分子量为270. 24的Γ3'8-三羟基-6-甲基蒽醌，其已商品化，下述 实施例中所用大黄素购于Sigma公司，其纯度彡98 %。取2. 7mg大黄素通过二甲基亚砜 (DMS0)助溶溶解于10mL双蒸水，超净台内0. 45μm-次性过滤器过滤除菌，即为ImM大黄 素母液，4°C冰箱储备备用。临用时用完全DMEM(10 %FCS、2mmol/mL谷氨酰胺、100U/mL青 霉素、l〇〇yg/mL链霉素和非必需氨基酸）稀释成不同浓度（0. 1μΜ，1μΜ，10μΜ，100μΜ， 1000以]\1)。0150终浓度低于0.2%。
[0042] 【实施例1】大黄素衍生物的制备、提纯及鉴定
[0043] 3-乙酸大黄素：取125mg大黄素和138mg碳酸钾加入5mL丙酮，50°C下回流反 应。反应结束后，加入盐酸调pH值1-2,过滤得红色固体，于真空干燥箱中烘干。将该产物 74. 3mg于圆底烧瓶加入34. 7mg氢氧化钠和15mL乙醇，30°C搅拌4h，将反应液放至无液体 析出，加水稀释，用盐酸调pH值1-2,用乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，硫酸钠干燥放干， 得到红色固体，通过核磁鉴定产物为3-乙酸大黄素（图1)。
[0044] 1，8-二己酰大黄素：取lg大黄素溶于50mL圆底烧瓶中，无水无氧操作，加入20mL 无水吡啶，_5°C搅拌，缓慢滴加3.lmL乙酰氯，反应8h，待原料已基本反应完，将反应液放干 加入100mL二氯甲烧稀释，分别用50mL的1M盐酸饱和碳酸氢钠溶液以及饱和含盐水各萃 取两次，有机相用无水硫酸镁干燥。将产物称取330mg与15. 8mg咪唑于25mL圆底烧瓶，无 水无氧操作于-5°C加入5mL甲基啦略烧酮，最后加入0.12mL苯硫酸反应4.5h。产物干燥 放干，得到淡黄色颗粒状固体，通过核磁鉴定产物为1，8-二己酰大黄素（图2)。
[0045] 【实施例2】MTT法检测大黄素衍生物3-乙酸大黄素和1，8-二己酰大黄素的细胞 毒性作用
[0046] 将健康献血者抗凝血与淋巴分离液（OrganonTeknikaCorp,Durham)混合，1500g 离心45min以分离单核细胞。收集单核细胞层，用DMEM悬浮，并接种到2%明胶包被的培养 皿中，于37°C孵育45min后，用DMEM洗去未黏附的细胞。贴壁细胞经EDTA消化后，用完全 DMEM(10%FCS、2mmol/mL谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和非必需氨基酸） 重悬，并按1〇5/孔接种于96孔板中。初步纯化后，经非特异性酯酶染色和荧光筛选⑶14单 克隆抗体（Leu-M3)及低密度脂蛋白（LDL)证实，孔内98. 5%的细胞为单核细胞，并经培养 7天后，分化为单核细胞来源的巨噬细胞（MDM)。分别加入100μL用DMEM(含2%胎牛血 清，V/V)稀释成不同浓度（0. 1μΜ，