一种α-L-鼠李糖苷酶在制备羟基脲糖苷衍生物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种a-L-鼠李糖苷酶在制备羟基脲糖苷衍生物中的应用，特别涉及 一种利用α-L-鼠李糖苷酶原始酶合成羟基脲鼠李糖苷的方法，属于糖工程技术领域。 技术背景
[0002] 羟基脲（Hydroxyurea)是一种核苷二磷酸还原酶抑制剂，作为细胞周期S期的特 异性抗肿瘤药物，主要用于治疗慢性粒细胞白血病、黑色素瘤、头颈部癌、卵巢癌等。近年 来，发现它对镰状细胞性贫血、β地中海贫血、银肩病、艾滋病等有一定疗效。羟基脲疗 效确切，用途广泛，但由于其极性大和半衰期短等缺点，极大限制了临床疗效。对羟基脲进 行分子改造，可提高其生物利用度，降低毒副作用。对抗肿瘤治疗药物进行鼠李糖基化修 饰，可增加药物的肿瘤靶向性，增强疗效。
[0003] 糖苷酶法对底物进行糖基化，步骤简单，成本低廉，条件温和，环境友好。但目前对 羟基脲的分子改造以化学合成为主，如中国专利文献CN1061775A(申请号91111219. 7)公 开了一种采用化学方法合成羟肟酸和N-羟基脲衍生物的方法；尚无糖苷酶法对羟基脲修 饰的报道。
[0004] 目前，对羟基脲的糖基化修饰仅有葡萄糖通过化学方法修饰的N-(β-D-吡喃葡 萄糖氧苷）脲一例，尚无鼠李糖基化修饰羟基脲的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种a-L-鼠李糖苷酶在制备羟基脲鼠李糖苷 衍生物中的应用。
[0006] -种羟基脲糖苷衍生物，名称为：羟基脲鼠李糖苷（1-Hydroxyureal-a-L-rhamn opyranoside)，化学结构式如下：
[0007]
[0008] -种a-L-鼠李糖苷酶在制备羟基脲糖苷衍生物中的应用，所述的a-L-鼠李糖 苷酶氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0009] -种酶法制备羟基脲鼠李糖苷的方法，包括如下步骤：
[0010] (1)用磷酸钠缓冲液配制鼠李糖浓度为〇· 3M~0· 5M，羟基脲浓度为0· 3M~0· 5M， 氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示的a-L-鼠李糖苷酶添加量为5μg~10μg/mL的反应体 系；
[0011] (2)将步骤⑴制得反应体系于45~60°C水浴中反应24~48小时，煮沸终止反 应，离心，取上清液；
[0012] (3)将步骤⑵制得的上清液，经分离、干燥后，制得羟基脲鼠李糖苷。
[0013] 所述步骤（1)中氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示的a-L-鼠李糖苷酶选用GenBank 登录号为JN704640. 1。上述a-L-鼠李糖苷酶对羟基脲具有显著转糖基活性。
[0014] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中的缓冲液为浓度10~lOOmM，ρΗ6~8的磷酸 钠缓冲液；根据本发明进一步优选的，所述步骤（1)中的缓冲液为50mM，ρΗ6. 5的磷酸钠缓 冲液。
[0015] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的离心为10000~12000转/分钟离心30分 钟。
[0016] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的反应条件为55°C水浴反应30小时。
[0017] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的煮沸终止反应条件为KKTC煮沸5分钟。
[0018] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中的分离采用薄层层析进行分离。进一步优选 的，所述的分离采用制备型薄层层析板分离。制备型薄层层析板可采用型号如Silicagel 60F254 (Merck,Germany)的薄层层析板。
[0019] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中的干燥为冷冻干燥。
[0020] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中还包括分离时的薄层层析检测，合并迀移距 离相同的产物的步骤。
[0021] 上述薄层层析检测的步骤如下：
[0022] 薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120°C烘烤5分钟使糖斑点 显色；
[0023] 上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比10 :3 :2混合配制；显色剂是体积百 分比为20%的硫酸和浓度为0. 5wt%的3, 5-二羟基甲苯的溶液。
[0024] 上述羟基尿鼠李糖苷在制备防治肿瘤药物中的应用。
[0025] 有益果
[0026] 1、本发明首次发现氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示的a-L-鼠李糖苷酶对羟基脲 具有显著转糖基活性，并成功合成了羟基脲鼠李糖苷；
[0027] 2、本发明以羟基脲为原料，以廉价鼠李糖底物为鼠李糖基供体，采用a-L-鼠李 糖苷原始酶合成羟基脲鼠李糖苷，产物与其原料羟基脲相比，含有鼠李糖基，增加了肿瘤细 胞靶向性，有助于提高原料药物的抗肿瘤活性，降低其毒副作用。
【附图说明】
[0028] 图1为实施例1制得的羟基脲鼠李糖苷的质谱图；
[0029] 图2为羟基脲鼠李糖苷的氢谱；
[0030] 图3为羟基脲鼠李糖苷的碳谱
[0031] 图4为羟基脲鼠李糖苷的氢氢相关核磁图谱；
[0032] 图5为羟基脲鼠李糖苷的碳氢直接相关核磁图谱；
[0033] 图6为羟基脲鼠李糖苷的碳氢远程相关核磁图谱；
[0034]图7为羟基脲鼠李糖苷的氢氢空间相关核磁图谱。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0036] pPIC9K质粒购自Invitrogen公司；
[0037]PichiapastorisGS115 购自Invitrogen公司。
[0038] 实施例1
[0039] 新型羟基脲鼠李糖苷衍生物，其制备步骤如下：
[0040] 1.a-L-鼠李糖苷酶的制备
[0041] 人工合成GenBank登录号为JN704640的a-L-鼠李糖苷酶序列（编码蛋白 GenBank登录号为AFA41506. 1，核苷酸序列如SEQIDΝ0. 2)，将其连接到pPIC9K质粒上，转 化PichiapastorisGS115。按照Invitrogen公司提供的毕赤酵母表达操作手册说明书制 备a-L-鼠李糖苷酶，考马斯亮蓝法测定酶蛋白含量，经检测，氨基酸序列如SEQIDNO. 1 所示。
[0042] 2.a-L-鼠李糖苷酶催化合成羟基脲鼠李糖苷
[0043] 用ρΗ6. 5、50mM磷酸钾钠缓冲液配制反应体系lmL，鼠李糖终浓度为0. 4Μ，羟基脲 终浓度为〇. 4M，a-L-鼠李糖苷酶的添加量为8μg/mL。在55°C反应30小时后，100°C煮沸 5分钟，终止反应。
[0044] 3.羟基脲鼠李糖苷的纯化
[0045] 将煮沸后的反应液12000转/分钟离心30分钟，吸取上清液，在制备薄层层析板 (PLCSilicagel60F254,Merck)点样展层。展层结束后，在层析板上每隔10cm取lcm宽 的条形小板显色，判定目标糖类在层析板上的位置，然后刮取层析板未显色区域含目标糖 苷的硅胶粉末，将其重新溶解于水中，离心取上清，冷冻干燥后所得粉末即为羟基脲鼠李糖 苷。
[0046] 上述薄层层析检测的步骤如下：
[0047] 薄层层析板点样，在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120°C烘烤5分钟使糖斑点 显色。
[0048] 上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比10 :3 :2混合配制；显色剂是体积百 分比为20%的硫酸和浓度为0. 5wt%的3, 5-二羟基甲苯的溶液。
[0049] 4.羟基脲鼠李糖苷的结构鉴定
[0050] 取上述羟基脲鼠李糖苷用水稀释为质量百分比为1%的溶液，进行质谱分析，目标 产物的特征分子离子峰（m/z)为[M+Na]+245. 08(如图1所示），判断产物分子量为222