一种用于治疗白血病的甾体类化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物技术领域，具体涉及从干燥的千金子中分离得到的一种具有治疗 急性T淋巴细胞白血病作用的留体类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 千金子亦称千两金、菩萨豆、续随子、联步、滩板救，为大戟科植物续随子 EuphorbialathyrisL.的干燥成熟种子，是我国传统中药材之一。千金子性温，味辛，具有 逐水消肿、破癥杀虫之功，用于水肿胀满、痰饮、宿滞、癥瘕积聚、妇女闭经、疥癣疮毒、蛇咬、 疣赘。在我国主要生长于河北、河南、浙江，此外四川、辽宁、吉林、湖南、广西等地亦产。国外 则主要广泛分布于中欧、南欧、俄国南部、南美、北美及澳大利亚。
[0003]综合文献报道，千金子含有47 %~50 %的脂肪油，15 %的蛋白质，还主要含有甾 醇、二萜酯及游离的二萜醇、香豆素类及其他化合物。
[0004]现在研究表明千金子具有抗肿瘤作用、抗菌作用、致泻作用、镇静催眠及镇痛抗炎 作用、抑制黑色素生成作用等。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种从干燥的千金子中分离得到的一种具有治疗急性T淋巴 细胞白血病作用的留体类化合物及其制备方法。
[0006]本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007]具有下述结构式的化合物(I)，
[0009]所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将干燥的千金子粉碎，用70 ~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的 正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸 乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用80%乙醇洗脱10个柱体 积，收集80 %乙醇洗脱液，减压浓缩得80 %乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中80 %乙醇洗脱浸 膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、25:1、15 :1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和 8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~12个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010]进一步地，所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂。
[0011] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为75%。
[0012] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的载 体。
[0013] 所述的化合物(I)在制备治疗急性T淋巴细胞白血病的药物中的应用。
[0014]所述的药物组合物在制备治疗急性T淋巴细胞白血病的药物中的应用。
[0015]本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016]该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017]所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018]图1为化合物(I)结构式；
[0019] 图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0021 ]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0022] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0023] 制备方法：（a)将干燥的千金子（10kg)粉碎，用75 %乙醇热回流提取(25LX3次）， 合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱和的 正丁醇（3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和正丁醇萃取物； (b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用 80%乙醇洗脱10个柱体积，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩得80%乙醇洗脱物浸膏（161g); (c) 步骤(b)中80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1(8个柱体积）、45:1 (8个柱体积）、25:1 (8个柱体积）、15:1 (10个柱体积)和1:1 (5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(52g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为 20:1(8个柱体积）、15:1(10个柱体积)和8:1(8个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3 个组分；（e)步骤(d)中组分2(26g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度 为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10-12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合 物（I)(237mg)。
[0024]结构确证：白色无定形粉末;册43頂3显示[1+似]+为111/2 431.2912，结合核磁特 征可得分子式为C28H4〇〇2，不饱和度为9。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρηι，DMS0_d6，500MHz):H-l(1.24，m)，H-l(1.76，m)，H-2(1.67，m)，H-2(1.98，m)，H-4(5.61，d，J=1.8)，H-6(3.08，m)， H-6(3.19，m)，H-8(2.13，m)，H-9(1.15，m)，H-ll(1.41，m)，H-ll(1.66，m)，H-12(1.02，m)，H-12(1.93，m)，H-14(1.45，m)，H-15(1.67，m)，H-15(1.91，m)，H-16(1.32，m)，H-16(1.56，m)， H-17(2.01，m)，H-18(0.61，s)，H-19(1.07，s)，H-21(1.68，s)，H-22(5.24，m)，H-23(2.53， m)，H-23(2.65，m)，H-25(2.ll，m)，H-26(0.93，d，J= 6.9)，H-27(0.92，d，J= 6.9)，H-28 (4.54，1^，(1，了=1.5)，!1-28(4.59,8);核磁共振碳谱数据5。（ ？?111，〇13〇-(16，1251取）：35.8 (CH2，1-C)，30.6(CH2,2-C)，201.7(C，3-C)，125.6(CH，4-C)，164.5(C，5-C)，46.1(CH2,6-C)， 203.6(C，7-C)，50.0(CH，8-C)，49.5(CH，9-C)，37.7(C，10-C)，20.8(CH2，11-C)，38.3(CH2， 12-C)，42.6(C，13-C)，49.5(CH，14-C)，25.8(CH2，15-C)，28.2(CH2，16-C)，54.3(CH，17-C)， 11.7(CH3，18-C)，17.1(CH3，19-C)，139.7(C，20-C)，21.8(CH3,21-C)，121.4(CH，22-C)，32.9 (CH2,23-C)，157.3(C，24-C)，33.4(CH，25-C)，21.7(CH3,26-C)，21.7(CH3,27-C)，105.6 (012,28-〇;碳原子标记参见图1。1!1-匪1?谱显示五个甲基信号[5!10.61(8，出-18)，0.92((1，了 =6.9抱，出-27)，0.93((1，了 = 6.9抱，!13-26)，1.07(8，!13-19)和1.68(8，!13-21)]，一个烯属亚 甲基[6财.54(1^，(1，了=1.5他，!1-28)和4.59(8，!1-28)]，两个烯属次甲基质子信号[6!15.24 (m，H-22)和5.61 (d，J= 1.8Hz，H-4)]，表明该化合物为甾体化合物。13C-NMR谱显示了28个碳 信号，包括五个甲基，九个亚甲基（一个烯属亚甲基），七个次甲基(两个烯属次甲基），以及 七个季碳(三个烯烃季碳，两个羰基季碳hHMBC谱中Μθ-18(δΗ0.61)与C-12(SC38.3)，C-13 (δ〇42·6)，C-14(SC49.5)和C-17(SC54.3)，以及Μθ-19(δΗ1.07)与C-1(SC35.8)，05(δ C164.5)，C-9(SC49.5)和C-10(SC37.7)的相关性表明该化合物为四环结构。核磁数据表明 该化合物含有一个α，β_不饱和酮羰基结构[δΗ5 · 61 (d，J= 1 · 8Hz，H-4);δ(：125 · 6 (C-4)， 164.5(05)和 201.7(03)]。两个低场碳信号[3(：121.4((：-22)和139.7((：-20)]和质子共振 信号[阳5.24(111，!1-22)]，表明该化合物含有一个三取代双键。此外，该化合物还含有一个二 取代双键[5财.54(1^，(1，了=1.5!^，!1-28)和4.59(8，!1-28)4(：105.6((：-28)和157.3((：-SOLNOESY谱中，Η-12α与H-17的相关性表明H-17为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY 谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通 过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0025]实施例2:化合物(I)药理作用试验 [0026] -、材料和仪器
[0027]急性Τ淋巴细胞白血病Molt4细胞由暨南大学血液病研究所惠赠;慢性粒细胞白血 病细胞K562细胞由暨南大学由生物化学与分子生物学教研室惠赠。化合物（I)为自制，HPLC 归一化纯度大于98%，用DMS0分析纯溶解配制成5.5yg/mL溶液备用。DMEM/F12培养基粉、羟 乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)、四苯基氮哇蓝试剂（MTT)购于美国Gibeo公司。新生牛血清 (NewbornCalfSerum)购于中国杭州四季青公司。青霉素（Penicillin)、链霉素 (Streptomycin)购于华北制药公司中国。碘化丙睫(PT)购于美国Sigma公司。PI-AnnexinV 双染试剂盒购于中国北京宝赛生物技术公司。R0S高质焚光测定试剂盒购于中国碧云天生 物技术研究所。