聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于高分子聚合物领域，尤其涉及聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙 烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物及制备方法。
【背景技术】
[0002] 聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS)是由维生素E琥珀酸酯的羧基与聚乙二 醇（PEG) 1000的羟基酯化而成，是经FDA认证的安全高分子材料，且TPGS已经载入《美国 药典》。聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯分子结构有亲水基团和亲油基团而有表面活性， 且因其独特的性质，被用作增溶剂、乳化剂、吸收促进剂等。因TPGS具有两亲性及良好的水 溶性，对水难溶性和亲脂性药物来说是个很理想的非离子性表面活性剂。美国Eastman是 最早开发TPGS并上市的公司，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯现在在药物制剂研究中已 经得到了广泛的应用。聚乙二醇（PEG)作为药物载体，具有体内长循环、延长半衰期、提高 药物的细胞摄取等优点。TPGS除了拥有PEG的优点外，在药物传递系统的应用中还具有更 大的优势：首先，TPGS可以显著提高药物包封率，从而能增强药物的细胞摄取，增加癌细胞 的死亡率；其二，与其他表面活性剂相比，TPGS具有生育酚酯的结构，从而有一定的抗氧化 性，这有助于增加制剂的稳定性；其三，可应用于前药设计，提高生物利用度；其四，有很多 报道声称，TPGS是一种P-糖蛋白抑制剂，它通过与P-糖蛋白上非转运活性位点结合，导致 P-糖蛋白构象改变，进而丧失转运功能。转运受P-糖蛋白阻滞的药物，如阿霉素、紫杉醇、 长春碱、秋水仙碱等，与TPGS合用后，都能明显增加药物在胃肠道内的吸收，提高其生物利 用度。
[0003] 聚乙烯亚胺（PEI)，为富含氮原子的阳离子高分子材料，分子量范围宽，多为lKDa到lOOOKDa之间，结构骨架（-CH2-CH2-NH_)中每3个原子含有一个氨基，与聚赖氨酸（PLL) 及树枝状高分子（PAMAM)具有类似性质。聚乙烯亚胺（PEI)是转染效率较高的阳离子聚合 物之一，被广泛用作DNA、寡核苷酸和siRNA等基因药物的阳离子聚合物载体系统。它分为 线状和分枝状两种分子结构，均可在生理条件下发生质子化，使得PEI具有较高的正电荷 密度，其带正电荷的氨基基团与核酸带负电荷的磷酸基团通过静电吸附作用而发生电性中 和，能够有效地压缩带有负电荷的DNA，形成稳定的纳米-核酸复合物，保护DNA免受血装 中DNA酶的降解，表面电荷呈中性或弱阳性，与表面带负电荷的细胞膜相互作用而进入细 胞内，具有较高的靶向性和转染效率。PEI的作用机制是当其携带DNA进入细胞后，在酸性 内涵体内发生质子化，导致离子内流，使得内涵体膨胀而破裂，即"质子海绵效应"，从而释 放出PEI/DNA复合物，促进DNA向细胞核内转运，实现基因转染。理想的非病毒载体基因递 送系统能够有效地规避网状内皮系统的吞噬和血浆中DNA酶的降解，穿透细胞膜，实现内 涵体的逃逸，从而成功地将DNA带入细胞核。聚乙烯亚胺（PEI)是一种广泛研究的用于基 因递送的非病毒载体，其主要优势具有良好的体外转染效果。然而随着PEI分子量的增加， 其潜在的细胞毒性也明显增大，尤其是平均分子量为25000的PEI。其次PEI体内稳定性 差，容易和血浆蛋白结合，从而被快速消除。由于这些缺点的存在，限制了PEI的应用。据文 献报道，将亲水性的多聚物如PEG修饰在PEI上，能够显著改善其PEI的药代动力学性质。 PEG化后的PEI/DNA复合物降低了表面正电荷，从而降低了PEI与血浆蛋白的作用，延长了 在血液中循环的时间，同时也降低了毒性。
[0004] 胆固醇（cholesterol)，又名胆甾醇，分子式为C27H460,它以醇或脂肪酸酯的形式 存在于所有动物的细胞中，尤其存在于脑和脊髓中。胆固醇为具有旋光性的白色结晶固体。 胆固醇是一切动物细胞作为细胞膜构造物的物质，使细胞膜能够"识别"并对通透细胞膜的 物质进行选择，让代谢废物透出膜外，而将维持细胞生命的有益物质保持。这些功能都基于 胆固醇特殊的化学结构、构型以及电荷分布。胆固醇作为生物膜的重要组成部分，能调节生 物膜的流动性，在相变温度以下增加生物膜的流动性；在相变温度以上能减小生物膜的流 动性。此外，胆固醇还具有增加生物膜机械强度和减小生物膜渗透性的功能。生物分子胆 固醇作为哺乳动物细胞重要组成部分之一，已被誉为"生物学中最具装饰性的小分子"。胆 固醇分子由于其高度的疏水性留醇骨架，良好的生物降解性和生物相容性，使得其是许多 水溶性聚合物疏水改性的最佳选择之一。胆固醇疏水改性的两亲性聚合物的自组装体系在 药物递送的应用方面近年来也受到越来越多的关注。
[0005] 基因治疗是将人正常的或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞来干预疾 病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上的缺陷或错误，杀灭病变 的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到治疗的目的。在基因治疗的实施中，有 四个重要的环节：一是寻找有效治疗基因，二是研制可以携带基因进入靶细胞进行表达的 有效安全的转基因载体体系，三是选择合适有效的转基因途径，四是如何使治疗基因在靶 细胞中特异性表达，发挥有效治疗作用。其中缺乏有效安全的转基因载体体系是制约基因 治疗实施的一个主要瓶颈。目前基因治疗使用最多的转基因载体是腺病毒和逆转录病毒载 体，约占治疗使用载体总数的50%。病毒载体具有很高的转基因效率，但使用病毒载体有许 多缺点，主要包括病毒载体有较强的免疫原性，大量使用会产生较强的免疫反应。此外病毒 载体的应用还有出现插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶性转化，而且病毒载体有限 的携带DNA能力，不利于大规模的生产也是限制其应用的主要缺点。非病毒载体与病毒载 体相比，其优点主要体现在非病毒载体很低免疫原性，不具备插入突变的能力，易于大规模 生产和生产成本较低。但非病毒载体的最大缺点是其转基因效率较低。理想的非病毒转基 因载体应该是可以降解的，毒性很低的，有较高转基因效率，并且具备靶向到目标细胞或是 组织的能力，使治疗基因在靶细胞或组织中发挥作用。
[0006] 因此，研究同时具有转基因效率高、可降解、毒性低的两亲性嵌段聚合物非病毒转 基因载体具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种转基因效率高、可降解、毒性低的具有两亲性的 聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物。
[0008] 本发明的第二个目的是提供聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆 固醇三嵌段聚合物的制备方法。
[0009] 本发明的第三个目的是提供聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆 固醇三嵌段聚合物在非病毒转基因载体中的应用。
[0010] 本发明的第四个目的是提供一种非病毒转基因载体。
[0011] 一种聚乙二醇1〇〇〇维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物，其具 有式（1)所述的结构式：
[0013]其中，η为 116-348 的整数，X为 20-25,Y为 3。
[0014] 本发明所述聚乙二醇1000维生素Ε琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物 生物相容性效果好，生物降解性好，毒性低。
[0015] 所述聚乙二醇1000维生素Ε琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的重均 分子量优选为56400-78000Da，此种重均分子量的聚合物具有良好的溶解性，稳定性，适宜 的Zeta电位值。
[0016] -种制备聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的 方法，主要包括如下步骤：
[0017] (a)聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与酰化试剂反应，得到活化聚乙二醇1000维 生素E琥珀酸酯；
[0018] (b)聚乙烯亚胺与胆固醇氯甲酸酯反应，得到聚乙烯亚胺-胆固醇；
[0019] (c)所述活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与所述聚乙烯亚胺-胆固醇反 应，得到聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物。
[0020] 其中，步骤（a)中，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的端羟基在酰化剂的作用下 发生酰化反应。所述酰化试剂为对硝基苯基氯甲酸酯、丁二酸酐中的一种，优选为对硝基苯 基氯甲酸酯。
[0021] 步骤（a)的操作优选为：按照聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与酰化剂的摩尔比 为1 :(1-2)使二者反应，得到粗产品溶液；向所述粗产品溶液中加入有机溶剂沉淀得到化 合物粗品，洗涤并干燥所述粗品，即得活化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯。
[0022] 由于酰化反应速率缓慢，因此，优选在反应体系中加入催化剂加快反应进程，所述 催化剂优选为二甲基氨基吡啶（DMAP)、吡啶中的一种或两种。
[0023] 步骤（a)的一种具体反应历程为：
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