一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及发酵培养技术领域，特别涉及一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养 方法、疫苗制备方法。
【背景技术】
[0002] 水貂出血性肺炎是由绿脓杆菌引起水貂的一种急性传染病，多发生于秋季温暖潮 湿，以咳嗽、呼吸困难、吐血、鼻出血为临床特症、以肺大面积出血、肺肝样变、肺水肿为主要 病变特征，发病率为20% -50%，死亡率为100%。病貂发病急，死亡快，常呈地方性暴发性 流行。近年来由于水貂养殖规模和集约化程度明显提高，水貂出血性肺炎的发病率显著上 升，该病危害程度逐年加深，已成为危害我国水貂养殖的主要传染病之一。
[0003] 鉴于该病的发病特点及该菌易产生耐药性问题，用药物治疗该病往往很困难， 灭活疫苗是预防该病的最有效方法，将水貂中流行的血清型的菌株灭活后制备成多价灭 活疫苗，可有效预防同类血清型菌株引起的该病，"水貂绿脓杆菌分离株的生物学特性比 较分析和血清型调查"，以及"水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及其制备方法"（专利号： ZL201010203879. 1)公开了我国引起水貂出血性肺炎的绿脓杆菌的主要血清型为G型和B 型，并利用这2种血清型菌株DL15(国家菌种保藏号CGMCCN0. 3811)和几08(国家菌种保 藏号CGMCCN0. 3812)研制出了可用于预防水貂出血性肺炎的二价灭活疫苗，2011年该产 品获得了农业部的临床试验批件，并同时进行了临床推广应用。经最小免疫剂量及免疫期 测定等研究实验表明，该菌菌数的多少与免疫原性高低呈直接相关性，因此提高疫苗菌数 直接决定着疫苗的质量及生产成本。
[0004] 目前，绿脓杆菌的培养方式主要为转瓶培养方法，如专利号ZL201010203879. 1的 专利公开了一种水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及其制备方法，其制备方法是使用转瓶进行 通气培养菌体，按PYG培养基体积的3%~4%接种，通气培养12~15h，菌数在20~40亿 CFU/mL之间，PYG培养基成分为：蛋白胨2 %，葡萄糖1 %，氯化钠0. 5 %，酵母粉0. 3 %，用去 离子水配制，配完调pH值7. 2~7. 4,116°C，30min。该方法不能充分利用培养基营养成份， 菌数低，产量低，工艺繁琐，生产周期长，生产成本高，生产量低，且易于污染，适用于疫苗研 制前期的小批量生产，不适用于规模化生产。
[0005] 申请号CN201210095852. 4的专利公开了一种水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗及制备 工艺，提及了用发酵罐生产绿脓杆菌，将菌种按2%体积加入到含2%胎牛血清的发酵培养 基中，在37°C通气搅拌培养12~16h，使用终浓度为0. 5%的甲醛灭活24h，该发明未提及 使用培养基成份，未提及生产工艺如通气量、pH值，气压，种子液的接种比例及存放时间，而 且所用的甲醛灭活浓度过高。申请人按该专利方法采用常规的发酵培养基及发酵参数进行 发酵，生产的菌数较少，无法满足产业化要求。因此，急需提供一种生产菌数多的绿脓杆菌 发酵培养基及其发酵培养方法。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备 方法。该发酵培养基适合绿脓杆菌高密度发酵生长，可大大提供绿脓杆菌的活菌数，在疫苗 研制的基础上大大提高了产量，使产品更利于市场推广应用。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种绿脓杆菌发酵培养基，包括蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠、 Na2HP04、KH2P04、MgS04、枸橼酸钠、尿素和复合维生素B。
[0009] 发酵生产过程中培养基成分对发酵结果有很大的影响，本发明通过大量研究发现 一种适合绿脓杆菌高密度发酵生长的发酵培养基，可大大提供绿脓杆菌的活菌数，在疫苗 研制的基础上大大提高了产量，使产品更利于市场推广应用。
[0010] 作为优选，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0011] 蛋白胨10~30份，葡萄糖10~30份，酵母粉1~3份，氯化钠4~6份，Na2HP04l~ 5份，ΚΗ2Ρ040 . 4~1. 6份，MgS040. 1~0. 5份，枸橼酸钠0. 1~0. 5份，尿素2~6份，复合 维生素B(λ0002~(λ0004份。
[0012] 优选地，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0013] 蛋白胨30份，葡萄糖20份，酵母粉3份，氯化钠5份，Na2HP042. 5份，ΚΗ2Ρ040· 83 份，MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 3份，尿素2份，复合维生素Β0. 0002份。
[0014] 在本发明提供的一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0015] 蛋白胨20份，葡萄糖30份，酵母粉3份，氯化钠5份，Na2HP042. 5份，ΚΗ2Ρ040· 83 份，MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 5份，尿素2份，复合维生素Β0. 0003份。
[0016] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0017] 蛋白胨30份，葡萄糖20份，酵母粉1份，氯化钠5份，Na2HP042. 5份，ΚΗ2Ρ040· 83 份，MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 5份，尿素6份，复合维生素Β0. 0003份。
[0018] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0019] 蛋白胨10份，葡萄糖10份，酵母粉1份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 · 4份， MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 1份，尿素2份，复合维生素Β0. 0002份。
[0020] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0021] 蛋白胨20份，葡萄糖20份，酵母粉2份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 · 4份， MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 1份，尿素4份，复合维生素Β0. 0003份。
[0022] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0023] 蛋白胨30份，葡萄糖30份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 . 4份， MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 1份，尿素6份，复合维生素B0. 0004份。
[0024] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0025] 蛋白胨10份，葡萄糖30份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HP045份，ΚΗ2Ρ041· 6份， MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 3份，尿素4份，复合维生素Β0. 0003份。
[0026] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0027] 蛋白胨20份，葡萄糖10份，酵母粉2份，氯化钠4份，Na2HP045份，ΚΗ2Ρ041· 6份， MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 3份，尿素6份，复合维生素Β0. 0004份。
[0028] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0029] 蛋白胨30份，葡萄糖10份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HP045份，ΚΗ2Ρ041· 6份， MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 5份，尿素4份，复合维生素Β0. 0004份。
[0030] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0031] 蛋白胨10份，葡萄糖20份，酵母粉2份，氯化钠5份，Na2HP042. 5份，ΚΗ2Ρ040· 83 份，MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 5份，尿素6份，复合维生素Β0. 0002份。
[0032] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0033] 蛋白胨20份，葡萄糖20份，酵母粉1份，氯化钠5份，Na2HP042. 5份，ΚΗ2Ρ040· 83 份，MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 1份，尿素2份，复合维生素Β0. 0004份。
[0034] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0035] 蛋白胨30份，葡萄糖30份，酵母粉2份，氯化钠5份，Na2HP042. 5份，ΚΗ2Ρ040· 83 份，MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 1份，尿素4份，复合维生素Β0. 0002份。
[0036] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0037] 蛋白胨10份，葡萄糖10份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 . 4份， MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 1份，尿素6份，复合维生素B0. 0003份。
[0038] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0039] 蛋白胨30份，葡萄糖10份，酵母粉2份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 . 4份， MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 3份，尿素2份，复合维生素B0. 0003份。
[0040] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0041] 蛋白胨10份，葡萄糖20份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 · 4份， MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 3份，尿素4份，复合维生素Β0. 0004份。
[0042] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0043] 蛋白胨20份，葡萄糖30份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HP045份，ΚΗ2Ρ041· 6份， MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 3份，尿素6份，复合维生素Β0. 0002份。
[0044] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0045] 蛋白胨10份，葡萄糖30份，酵母粉2份，氯化钠4份，Na2HP045份，ΚΗ2Ρ041· 6份， MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 5份，尿素2份，复合维生素Β0. 0004份。
[0046] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0047] 蛋白胨20份，葡萄糖10份，酵母粉3份，氯化钠4份，Na2HP045份，ΚΗ2Ρ041· 6份， MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 5份，尿素4份，复合维生素Β0. 0002份。
[0048] 作为优选，复合维生素B包括生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇或尼古丁酸 中的一种或两种以上的混合物。
[0049] 作为优选，生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇与尼古丁酸的质量比为（10~ 20) : (1 ~5) : (150 ~200) : (1000 ~1200) : (400 ~500) : (400 ~500)。
[0050] 作为优选，生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇与尼古丁酸的质量比为20 :2 : 200 :1000 :400 :400〇
[0051] 作为优选，培养基的pH值为7. 0~7. 2。
[0052] 在本发明提供的一些实施例中，该发酵培养基的制备方法为：将蛋白胨、葡萄糖、 酵母粉、氯化钠、Na2HP04、KH2P04、MgS04、枸橼酸钠、尿素、复合维生素B溶于水中，调节pH值 至7. 0~7. 2,灭菌。
[0053] 该培养基中各组分用量为：蛋白胨10~30g/L，葡萄糖10~30g/L，酵母粉1~ 3g/L，氯化钠 4 ~6g/L，Na2HP04l~5g/L，KH2P040 . 4 ~1. 6g/L，MgS040. 1 ~0. 5g/L，枸橼酸 钠(λ1~(λ5g/L，尿素2~6g/L，复合维生素B(λ0002~(λ0004g/L，水补足。
[0054] 本发明还提供了一种绿脓杆菌的发酵培养方法，包括如下步骤：
[0055] -级种子制备：取绿脓杆菌冻干菌接种于琼脂培养基，36~37°C培养18~24h， 挑菌落接种于斜面培养基，36~37°C培养18~24h，获得一级种子；
[0056] 二级种子制备：取一级种子接种于液体培养基，36~37°C培养12h，然后再接种于 液体培养基，36~37°C培养12h，获得二级种子；
[0057] 发酵种子液制备：将二级种子接种于发酵培养基，在温度37~37. 5°C、搅拌速度 100~120r/min、进气流量70~90L/min、压力30~70Kpa条件下发酵培养7h，获得发酵 种子液；
[0058]-级发酵：取发酵种子液接种于发酵培养基，在温度37~