可溯源性非荧光标记大肠杆菌及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种可溯源性非荧光标记大肠杆菌及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli)作为一种模式生物，其一个重要方面是可 以通过改造后作为宿主菌生产各种有用的产品，比如燃料、蛋白质和聚合物等等。早先大肠 杆菌改造方面，比如有非必需基因敲除技术、内源性或外源性基因高效表达技术等。其中， 内源性或外源性基因高效表达技术多借助于质粒这一工具，通过质粒将目的基因重组并导 入表达，具有操作方便、表达可控等等优点。但是该方法一方面由于拷贝数和质粒自身携带 的多种其他DNA，使得增加宿主菌的代谢负担，从而影响宿主生长；另一方面是质粒在宿主 菌中的维持都需要使用相应抗生素，从而增加了该抗性特点向环境中其他微生物传播的风 险。
[0003] 因此，在上述基础上，为了避免上述缺陷在大肠杆菌基因组工程改造方面，现常采 用转座子的基因插入技术。但是该方法插入过程中，由于转座子介导的基因插入具有随机 性常导致插入位点无法控制，所以需要进行特异位点导向的基因插入技术多借助于λ噬 菌体的重组酶（Red系统）实现，它们由gam、bet和eX〇编码。该系统具有的优点之一是基 因插入位点可以自由选择，将Red系统和一些条件型质粒（如温度敏感性质粒）结合使用， 可实现除了在基因组中插入目标基因外不留下其他任何痕迹的目的，从而最大限度地降低 了其他外源基因对宿主菌的影响。而且该插入和标记改造方法有利于后续的跟踪溯源。
【发明内容】
[0004] 本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种在大大降低对宿主 影响的条件下，准确实现基因插入并方便后续跟踪溯源的可溯源性非荧光标记动大肠杆菌 及其制备方法。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0006] -种可溯源性非荧光标记大肠杆菌的制备方法，包括如下步骤：
[0007] 以pKD4为模板，通过pKD4扩增引物PCR扩增，得到含有与待改造大肠杆菌manX 基因同源序列的FRTcassette产物；其中所述pKD4扩增引物包括上游引物HP1和下游引 物HP2 ;所述上游引物HP1具有序列表SEQ.ID.No. 1的碱基序列，所述下游引物HP2具有序 列表SEQ.ID.No. 2的喊基序列；
[0008] 将pKD78质粒转入待改造大肠杆菌中，获得含有pKD78质粒的大肠杆菌；
[0009] 将所述FRTcassette产物转入含有PKD78质粒的大肠杆菌中进行定点重组，形成 重组大肠杆菌；
[0010] 通过自杀质粒pCP20敲除所述重组大肠杆菌染色体FRTcassette中的卡那霉素 抗性基因。 toon] 本发明进一步还提出根据上述方法制备得到的可溯源性非荧光标记大肠杆菌。
[0012] 本发明改造后的大肠杆菌最终大肠杆菌的基因组中只在定点位置留下了一个不 多于50个核苷酸的FRT痕迹，大大降低了插入序列对宿主菌的影响，并且不会改变置入宿 主后导致抗性特点的传播，并且该FRT痕迹能方便后续该改造菌株的跟踪溯源。
【附图说明】
[0013] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0014] 图1为本发明可溯源性非荧光标记大肠杆菌的制备方法示意图；
[0015] 图2为本发明验证FRTcassette是否插入大肠杆菌的电泳图；
[0016] 图3为本发明验证FRTcassette是否插入大肠杆菌manX基因位点的电泳图；
[0017] 图4为本发明验证FRTcassette中的卡那霉素抗性基因是否被敲除的电泳图；
[0018] 图5为本发明验证卡那霉素抗性基因被敲除后大肠杆菌基因中FRT遗留痕迹的电 泳图。
【具体实施方式】
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0020] 本发明实施例提供一种可溯源性非荧光标记大肠杆菌的制备方法，方法示意图参 见图1，包括如下步骤：
[0021] S10,以pKD4为模板，通过pKD4扩增引物PCR扩增出含有与manX基因同源序列的 FRTcassette产物；
[0022] S20,将pKD78质粒转入待改造大肠杆菌中，获得含有pKD78质粒的大肠杆菌；
[0023]S30,将FRTcassette产物转入含有pKD78质粒的大肠杆菌中与大肠杆菌的染色 体进行定点重组，形成重组大肠杆菌；
[0024]S40,通过自杀质粒pCP20去除重组大肠杆菌染色体FRTcassette中的卡那霉素 抗性基因，即得到本发明可溯源性非荧光标记大肠杆菌。
[0025] 其中在上述步骤S10中，pKD4扩增引物包括上游引物HP1和下游引物HP2 ;
[0026] 其中上游引物HP1具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，下游引物HP2具有序列 表SEQ.ID.No.2的喊基序列；
[0029] 其中上游引物HP1和下游引物HP2设计基于大肠杆菌E.coli基因组中manX基因 序列（参见序列表SEQ.ID.No. 3的碱基序列），以pKD4中的FRTcassette序列（参见序 列表SEQ.ID.No.9的碱基序列）为模板，通过上述上游引物HP1和下游引物HP2扩增得到 的FRTcassette在序列的两端引入了manX基因同源序列，因此便可以在之后的步骤中实 现定点植入。
[0030] 进一步在步骤S30中将上述扩增出具有manX基因同源序列的FRTcassette产物 导入大肠杆菌中进行定点重组。并且在该过程中大肠杆菌受体为步骤S20转化后获得的含 有PKD78质粒的大肠杆菌；步骤S30的完成其是基于pKD78质粒协助完成，因为pKD78质粒 自身可以表达与λ噬菌体等同的Red系统重组酶；Red重组系统由三种蛋白组成：Exo蛋白 是一种核酸外切酶，结合在双链DNA的末端，从5'端向3'端降解DNA，产生3'突出端；Beta 蛋白结合在单链DNA上，介导互补单链DNA退火；Gam蛋白可与RecBCD酶结合，抑制其降解 外源DNA的活性。该Red系统重组酶系统的特点是可以识别同源序列，并在同源序列位置 进行外源DNA的插入重组。因此，在上述步骤S10中通过上述引物扩增出的manX基因同源 序列的FRTcassette产物便可以在大肠杆菌特定manX基因的位点植入FRTcassette,定 点植入后与manX基因形成的序列参见序列表SEQ.ID.No. 10。
[0031] 进一步在步骤S40中，采用自杀质粒pCP20去除重组大肠杆菌染色体FRT cassette中的卡那霉素抗性基因；该自杀质粒pCP20的特点在于可以表达翻转酶并能特异 性识别FRT序列，并在宿主中将识别位点之后的一段抗性基因敲除。因此在本发明中于该 步骤S40中采用该自杀质粒pCP20去除重组后大肠杆菌染色体FRTcassette中的卡拉霉 素抗性基因，在最终大肠杆菌的基因组中只留下了一个不多于50个核苷酸的FRT痕迹，大 大降低了插入序列对宿主菌的影响，并且不会改变置入宿主后导致抗性特点的传播，并且 由于该FRT痕迹能方便后续该改造菌株的跟踪溯源。
[0032] 而其中，在上述实施过程中，除了上述主要步骤S10-S40之外，在实际操作中，更 重要的还需要配套进行各阶段的验证步骤，因为每一个过程进行是否成功直接影响最终的 改造菌株的结果。而在这些步骤过程中，并不存在比较通用的检验方式，因此在本发明上述 步骤实施过程中按照下述方法补充进行，以保证过程的正确实施和目的改造菌株的正确获 得。
[0033] 其中，在步骤S30之后，可以采用FRTcassette验证引物进行PCR进行验证FRT cassette是否准确插入到了大肠杆菌manX基因区域；其中FRTcassette验证引物包括具 有序列表SEQ.ID.No. 4碱基序列的验证引物1、具有序列表SEQ.ID.No. 5碱基序列的验证引 物2、具有序列表SEQ.ID.No. 6碱基序