病毒纯化放大方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物领域，特别是涉及病毒纯化放大的方法。
【背景技术】
[0002]为提尚血液制品、生物组织提取制品以及真核细胞表达制品的安全性，预防生物制品原料中可能潜在的病毒对人的危害，生物制品的生产工艺中需要包含能有效地清除/灭活这些潜在病毒的工艺步骤，以确保制品的生物安全性。
[0003]验证生产工艺中的病毒清除/灭活工艺步骤是否有效的，需要在样品中人为加入一定种类和数量的指示病毒。纳米膜过滤是病毒去除验证中的常用方法，为达到足够的病毒清除系数，确保生物安全性以通过国家评审，样品中需要加入足量的指示病毒，指示病毒的体积和杂质含量直接影响到纳米膜过滤的通量。
[0004]指示病毒的滴度越低，需要加入病毒的体积越大，随之，大体积的病毒料液越可能影响到样品料液的物理性质，如粘度，从而造成纳米膜过滤的通量降低。指示病毒杂质含量越高，越容易造成病毒在纳米膜表面截留，也会造成纳米膜过滤的通量降低。纳米膜过滤的通量降低，为获得足够的病毒清除系数，在单位面积的纳米膜上，样品的处理量就必须减少。
[0005]病毒清除/灭活验证中，使用高滴度、低杂质的指示病毒，可减少样品中病毒掺入的体积百分比，减少病毒在纳米膜表面截留，从多方面增加纳米膜过滤的通量，减少过滤膜的面积。病毒清除/灭活验证中纳米膜过滤的通量增加几倍，同样的病毒清除/灭活工艺运用到生物制品中试生产，甚至产业化时，所需病毒过滤膜的面积也会相应缩小，这能大大减少病毒过滤膜投入成本。
[0006]为获得高低度、低杂质的指示病毒，需对病毒料液进行纯化。病毒纯化的传统方法有超速离心法、沉淀法、超滤法，这些方法可用于小规模的病毒纯化，但因设备的局限性，纯化效率低，很难进行放大纯化生产，且病毒纯度不是很理想(参见申请号为CN201510183392.4、名称为“一种重组单纯疱疹病毒的纯化方法”的中国专利申请)。对于一些较脆弱的病毒，如包膜病毒，超速离心带来的物理作用甚至会造成病毒结构破坏，导致病毒失去生物活性。因此，需要采取别的方法来获得高纯度、高滴度的病毒，且能进行放大。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种病毒纯化放大方法，它可以进行大规模病毒纯化，获得低残留、高纯度、高滴度的病毒，增加病毒清除验证中病毒过滤膜的通量，降低病毒过滤膜成本投入。
[0008]为解决上述技术问题，本发明的病毒纯化放大方法，步骤包括:
[0009]1.病毒纯化放大方法，其特征在于，步骤包括:
[0010]1)去除病毒中的细胞碎片；
[0011]2)采用层析法捕获病毒；
[0012]3)用核酸酶处理步骤2)捕获的病毒，酶解病毒中的宿主细胞核酸；
[0013]4)对步骤3)处理后的病毒进行精细纯化，去除宿主细胞蛋白、核酸片段。
[0014]上述步骤1)，可以采用中速离心法去除细胞碎片，优选在13000g离心力下离心10分钟。
[0015]上述步骤2)，优选离子交换层析法捕获病毒。
[0016]上述步骤2)，宜采用选择性不高、载量和耐压性高(耐压1500psi以上)的层析填料捕获病毒，优选膜层析介质。层析柱的体积优选为500ml以上，直径优选为5cm以上。
[0017]上述步骤3)，可以采用Benzonase核酸酶处理病毒1小时。
[0018]上述步骤4)，可以采用凝胶层析法精细纯化病毒。
[0019]本发明应用层析法实现病毒纯化放大，并在层析柱、层析填料方面进行优化，相较于传统病毒纯化方法，不仅提高了纯化后的病毒纯度和滴度，而且具有易放大、成本低的优点。所得低残留、高纯度、高滴度的病毒运用到病毒清除验证中，可增加病毒过滤膜的通量，降低病毒过滤膜的成本投入。
【具体实施方式】
[0020]为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发明详述如下:
[0021]本实施例应用层析法进行病毒纯化放大的具体方法如下:
[0022]步骤1，采用中速离心法(通常13000g离心10分钟)去除细胞碎片，获得粗澄清的病毒料液。
[0023]为延长层析填料使用寿命，需在层析前去除细胞碎片及大分子宿主蛋白。
[0024]步骤2，采用离子交换层析法捕获病毒，减小病毒原液体积，实现浓缩效果。
[0025]病毒捕获是大规模病毒纯化的关键步骤，主要目的是缩小病毒原液体积，提高病毒滴度，方便后续的病毒纯化。可采用选择性不是很高，但载量高的层析填料，如离子交换层析填料，利用离子交换色谱填料上的带电基团与病毒表面不同带电组分的相互作用，将病毒捕获。
[0026]步骤3，用核酸酶Benzonase处理步骤2捕获的病毒1小时，以酶解宿主细胞核酸，减少核酸残留。
[0027]细胞被病毒感染后，发生病变、裂解，释放大量核酸；病毒经步骤2浓缩后，料液中的宿主细胞核酸浓度也增加，造成料液粘稠度增加，不利于病毒的精细纯化。采用核酸酶Benzonase处理1小时，长链的核酸被酶解成小片段，可以降低料液粘稠度，小片段的核酸可以通过后续的步骤4去除。
[0028]步骤4，采用凝胶层析法对步骤3处理后的病毒进行精细纯化分离，去除宿主细胞蛋白、核酸片段等非病毒成分，以获得纯度高、杂质少的病毒。
[0029]病毒清除验证中常用的指示病毒X-MuLV和PrV为有包膜的DNA病毒，其颗粒大小分别为80-120nm、120_200nm，针对这一类大颗粒的病毒，采用凝胶层析法，将大颗粒的病毒与宿主蛋白以及核酸片段分离开，可以获得高纯度的病毒。
[0030]在步骤2病毒捕获阶段，为实现大规模的病毒液浓缩，可以从两方面进行改造:一是层析柱，二是层析填料。
[0031]扩大层析柱的体积，可以增加层析填料的体积到500ml以上，提高病毒原液处理量。为控制层析进样时的压力，通常选择增加层析柱的直径(一般增加至5cm以上)，而非层析柱的高度。层析柱直径增加，病毒原液的单位时间进样量增加，从而可以将病毒原液的处理量提高到10L以上。
[0032]层析填料的选择，除考虑载量外，还应考虑耐压性。耐压性提高，高耐压的填料可以承受高流速，单位时间的病毒原液处理量也可提高。此外，除了选择传统的层析填料外，还可选择新型层析介质，如膜层析介质。膜层析的基质由稳定化的再生纤维素作为骨架，并带结合不同功能基团，根据病毒表面的电荷分布，可以选择具有不同功能基团的膜吸附器。由于膜层析介质具有大孔径结构，能够让大分子及病毒进入膜内，并结合至内孔表面，故而与传统柱层析相比，膜吸附层析具有易于操作处理(无需填装，即插即用)、高流速(比柱层析提高10-30倍)、传质扩散效应低、高载量、非特异性吸附低、硬件投资更少、缓冲液消耗更少、易于放大等诸多优点。
[0033]通过以上步骤获得的病毒，其DAN残留不超过10ng/ml，蛋白残留不超过300 μ g/ml ο将经离心法获得的病毒用于病毒清除验证中，病毒与样品的体积比通常需达到2%，且单位面积的病毒过滤膜的流通量不高。将经本方案纯化获得的病毒用于病毒清除验证实验中，病毒与样品的体积比不超过0.5%即可获得大于4个Log值的病毒清除，而且单位面积的病毒过滤膜的流通量可增加3倍。
【主权项】
1.病毒纯化放大方法，其特征在于，步骤包括: 1)去除病毒中的细胞碎片； 2)采用层析法捕获病毒； 3)用核酸酶处理步骤2)捕获的病毒，酶解病毒中的宿主细胞核酸； 4)对步骤3)处理后的病毒进行精细纯化，去除宿主细胞蛋白、核酸片段。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)，采用中速离心法去除细胞碎片。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)，在13000g离心力下离心10分钟。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)，所述层析法为离子交换层析法。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)，所述层析法采用耐压1500psi以上的层析填料。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述层析填料包括膜层析介质。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)，层析柱的体积为500ml以上，直径为5cm以上。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)，采用Benzonase核酸酶处理病毒1小时。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)，采用凝胶层析法纯化病毒。
【专利摘要】本发明公开了一种病毒纯化放大方法，步骤包括：1)去除病毒中的细胞碎片；2)采用层析法捕获病毒；3)用核酸酶处理步骤2)捕获的病毒，酶解病毒中的宿主细胞核酸；4)对步骤3)处理后的病毒进行精细纯化，去除宿主细胞蛋白、核酸片段。本发明应用层析法实现病毒纯化放大，并在层析柱、层析填料方面进行优化，相较于传统病毒纯化方法，不仅提高了纯化后的病毒纯度和滴度，而且具有易放大、成本低的优点；所得低残留、高纯度、高滴度的病毒运用到病毒清除验证中，可增加病毒过滤膜的通量，降低病毒过滤膜的成本投入。
【IPC分类】C12N7/02
【公开号】CN105420202
【申请号】CN201511016482
【发明人】范洁, 姜东秀, 塞伦苏, 刘大钧
【申请人】苏州药明康德检测检验有限责任公司, 无锡药明康德生物技术股份有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月30日