一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种胞外核酸酶及其用途，特别涉及一种新型的结核分枝杆菌胞外核 酸酶及其用途，本发明属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 许多种细菌能产生胞外核酸酶，胞外核酸酶对于细菌的毒力、生物被膜的形成、利 用胞外DNA获取营养和降解胞外诱捕网（NETs)中的DNA中起着重要作用。比如希瓦氏 菌、沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌的胞外核酸酶能够降解胞外的DNA以获取其基本的营养成 分-磷源，碳源和氮源。Seper的最近研究表明野生型的霍乱弧菌能通过其本身的两种胞外 核酸酶（Dns和Xds)降解NETs中的DNA成分。金黄色葡萄球菌的胞外核酸酶也能降解NETs， 进而引发半胱天冬酶-3介导的免疫细胞死亡。然而无乳链球菌的胞外核酸酶（Gbs0661) 能够攻击NETs并且是细菌毒力所必须的。（NETs-中性粒细胞胞外诱捕网是宿主的防御反 应中一个重要组成部分，能够固定微生物随后并清楚）。在葡萄糖缺乏的培养基中，枯草芽 孢杆菌168的孢子形成阶段释放的脱氧核糖核酸酶（NucB)能够降解生物被膜的重要核酸 为自身利用。
[0003] 结核分枝杆菌（M.tuberculosis)是革兰氏阳性细菌，是引起结核病的病原菌。结 核病一直是世界上死亡率最高的疾病之一。2013年，大约有900万人感染结核病，约有150 万人死于这种疾病，其中36万人是HIV阳性。结核分枝杆菌进入肺之后，被巨噬细胞和树 突状细胞所吞噬，然而结核分枝杆菌能够在这些免疫细胞中扩散，甚至逃脱这些吞噬体迀 移到淋巴结而扩散感染。
[0004] 革兰氏阳性细菌的胞外核酸酶在细菌的毒力和降解胞外诱捕网（中性粒细胞或 者巨噬细胞释放）的DNA方面起着非常重要的作用。之前有关胞外核酸酶的研究主要集中 在无乳链球菌，化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌。虽然之前报道描述过结核分枝杆菌胞内 核酸酶，但是至今没有数据显示结核分枝杆菌存在胞外核酸酶。在次，本发明首次发现并证 实Rv0888蛋白是结核分枝杆菌的胞外核酸酶。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶及其用途。
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种能够抑制所述结核分枝杆菌胞外核酸酶的抑制 剂。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0008] 在本发明中，我们证实了Rv0888蛋白是第一个来自于结核分枝杆菌的胞外核酸 酶，属于endonuclease/exonuclease/phosphatase家族（PfamfamilyPF03372)，在结核分 枝杆菌的培养滤液中能检测到鞘磷脂酶的活性。进一步的，本发明还证明了该胞外核酸酶 在降解不同类型的核酸（基因组DNA，双链PCR产物，质粒DNA和面包酵母RNA)方面具有高 度的活性，Rv〇888发挥其核酸酶活性需要二价离子的辅助（Ca2+和Mn2+)。另外四种中药单 体（6-姜酚，类叶升麻苷，橄榄苦苷，补骨脂乙素）能够抑制Rv0888的核酸酶活性。
[0009] 在此基础上，本发明提出了一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶，命名为Rv0888， 其氨基酸序列如SEQIDN0. 1、SEQIDN0. 3或SEQIDN0. 5所示。
[0010] 进一步的，本发明还提出了编码所述的结核分枝杆菌胞外核酸酶的核苷酸序列。 优选的，所述的核苷酸序列如SEQIDN0. 2、SEQIDN0. 4或SEQIDN0. 6所示。
[0011] 含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也自然落在 本发明的保护范围之内。
[0012] 再进一步的，本发明还提出了所述的结核分枝杆菌胞外核酸酶在降解核酸中的用 途。
[0013] 其中，优选的，所述的核酸包括线性双链DNA，环状质粒DNA，染色体DNA或者RNA。
[0014] 更进一步的，本发明提出了橄榄苦苷，6-姜酚，补骨脂乙素或类叶升麻苷在抑制所 述的结核分枝杆菌胞外核酸酶中的用途。
[0015]Rv0888核酸酶活性显示在33°C-51°C的温度范围内，最佳的温度是41°C。这个温 度与人和动物在感染结核分枝杆菌后体温升高是一致的，表明Rv〇888也许与结核分枝杆 菌的毒力有关。与其他的脱氧核糖酸酶/核酸酶相似，Rv〇888核酸酶发挥活性也需要二价 离子。最佳的二价离子是Mn2+以及Ca2+，其他的二价离子（Mg2+，Ba2+，Ni2+)也有不同程度的 促进作用（表1)。这些结果表明与之前报道的大肠杆菌核酸酶一样，Rv〇888的催化活性位 点与二价离子的直径没有关系，而是这些离子结合在不同的氨基酸维持其活性。金属螯合 剂EDTA对Rv0888的活性起着很强的抑制效果，表明金属离子对于核酸活性是必须的，并且 在酶结构稳定性方面起着非常重要的作用。
[0016] 氨基酸置换研究表明D438位氨基酸在Rv0888核酸酶活性方面起着关键的作用， H353和D387在Rv0888活性方面也起着比较积极的作用。与其他的含有保守基序的DRGH 的肺炎链球菌胞外核酸酶EndA22和DKGH的无乳链球菌的胞外核酸酶Gbs06616相比，这些 重要的氨基酸残基与他们是不同的。Rv〇888蛋白与其他已知的核酸酶没有任何同源性（图 9)，因此我们的数据表明Rv0888是一个非特异性核酸酶家族成员之一。
[0017]由于肺结核与HIV共感染和新出现的无法治疗的或者广泛耐药的结核分枝杆菌， 使得肺结核很难控制。迫切需要研发新的药物和更有效的疫苗。因此需要在遗传基础上理 解结核分枝杆菌的毒力和致病性。有趣的是四种中药单体（橄榄苦苷，类叶升麻苷，6-姜 酚，补骨脂乙素）能够抑制Rv〇888活性。之前有关抑制剂的研究主要集中在小分子抑制 剂，主要是蛋白和病原体生物合成相关的因子：例如，结构同源物ML141阻止金黄色葡萄球 菌进入内皮细胞；半胱氨酸蛋白酶抑制剂K11777阻塞冠状病毒和线状病毒进入宿主细胞； 在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的ItaS表达过程中，化合物1771能阻塞磷脂酰甘油-LtaS 的结合和抑制LTA的合成；使用BAS00127538抑制鲍曼不动杆菌LipidII( -个细胞壁生 物合成的前体）通过。随后的药物研究转移到细胞壁蛋白和蛋白酶上：分选酶抑制剂能够 用于治疗医院内感染的金黄色葡萄球菌的感染而没有标准抗生素的副作用；结核分枝杆菌 磷脂酶/硫酯酶（Rv3802c)抑制剂奥利司他；通过有机催化获得的肺结核的一个毒力因子 mPTPB的抑制剂；六种小分子被证实能够抑制肺炎链球菌表面核酸酶EndA31 ;重要的是，我 们首次报道了中药单体能有效的抑制细菌的核酸酶。现在对于广泛耐药的病原体，新药研 究逐渐转向中药。因此验证新的毒力因子并且筛选中药抑制剂，也许有利于我们发现新的 治疗结核病的药物。
[0018] 体内感染试验表明重组耻垢分支杆菌Rv0888NS/MS和Rv0888S/MS在小鼠感染17d 时继续在肺中持留，组织病理学分析显示感染7d时小鼠的肺有明显的病理变化，这就意味 着Rv0888也许是结核分枝杆菌的一个毒力因子，可能与结核分枝杆菌在宿主肺中的持留 有关。之前研究已经报道了不同细菌核酸酶在细菌中定位：化脓性链球菌分泌到培养上清， 肺炎链球菌的核酸酶定位在膜上和化脓性链球菌，猪链球菌定位在肽聚糖上。结核分枝杆 菌Rv0888含有信号肽并且能分泌到培养液中。这种分泌的形式比定位在膜上的核酸酶-像 肺炎链球菌EndA-对于结核分枝杆菌的致病性更有效，因为它们更容易接近它们的底物。 在这项研究中Rv〇888核酸酶的特性使我们更容易理解结核分枝杆菌的致病性并且也许对 于我们获得新的治疗结核病的药物具有帮助作用。
【附图说明】
[0019] 图1为重组Rv0888蛋白纯化和质谱验证；
[0020] (A)Rv0888 蛋白亲和纯化的SDS-PAGE分析 20mMTris-HCl-150mMNaCl-10 % glycerol含有浓度梯度的咪唑洗脱Rv0888蛋白。l:500mM咪唑；2:200mM咪唑；3:100mM咪 唑；4:80mM咪唑；5:70mM咪唑；6:60mM咪唑；7:40mM咪唑；8:20mM咪唑；M:蛋白分子质量 Marker。（B)离子交换层析纯化Rv0888蛋白。（C)凝胶过滤层析纯化Rv0888蛋白。（D) Rv0888蛋白通过基质辅助的激光解析离子分行时间质谱肽质量指纹图谱。与Rv0888蛋白 匹配一致的序列框内显示。
[0021 ] 图2为纯化的Rv0888蛋白消化不同的核酸；
[0022] 反应条件为：20mMTris-HClpH7. 5and5mMMgC1237°C孵育 1 小时。（A)纯化的 Rv0888 蛋白消化不同DNAJzDLSOOODNAMarker;l:染色体DNA与 20mMTris-HCl(pH7.5); 2:染色体DNA和纯化的Rv0888 ;3:环状质粒DNA与20mMTris-HCl(pH7. 5) ;4:环状质粒 DNA与纯化的Rv0888 ;5:线性双