西瓜ClCP2基因的启动子及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地指一种西瓜ClCP2(Cla016594)基因的 启动子及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 植物基因的启动子是位于基因5'端上游区、含有顺式作用元件的一段DNA序列，决 定着下游基因转录的特异性、方向和效率，是基因转录调控机制和表达模式中最关键的因 子。此外，外源基因在植物细胞中表达是植物基因工程研究的关键，而外源基因的表达首先 取决于其转录的启动，在某种程度上，启动子决定了基因表达的时空顺序以及表达强度。因 此，发掘和研究新型启动子对于基因表达调控机制研究和转基因研究具有非常重要的科学 意义。
[0003]通过对多种植物基因启动子区的分析发现，绝大多数功能蛋白基因的启动子都具 有共同的结构模式，一般由启动子核心元件和上游元件组成。位于转录起始位点上游-20 ~-30bp处的TATAbox为启动子核心元件，是富含有AT的保守序列区，与DNA(脱氧核糖核 酸)双链的解链有关，并决定转录起始点的选择，是绝大多数植物启动子正确表达所必需 的。TATAbox上游的保守序列称为启动子上游元件，包括上游-75bp处的CAATbox和-80- llObp附近的GCbox等一般上游启动子元件及其他特殊的上游元件，如R00TM0TIFTAP0X1根 特异调控元件、参与植物胁迫应答响应元件W-box(TGACC)等(杜皓等，受多逆境诱导表达的 GMRKY64基因启动子克隆与功能分析。作物学报，2015,41(4) :593-600)XAATbox是比较 保守的序列，与RNA(核糖核酸)聚合酶的识别和结合有关，对基因转录有较强的激活作用。 然而有些基因无此框，如禾谷类作物的贮藏蛋白基因中无CAAT框而被CATC框代替。GCbox 的保守序列是5YGGCGG3'，可有多个拷贝，并能以任何方向存在而不影响其功能(路静，赵 华燕，何奕昆，宋艳茹，高等植物启动子及其应用研究进展。自然科学进展，2004，14(8): 856-862;夏江东，陈在全，吴渝生，季鹏章，高等植物启动子功能和结构研究进展。云南农业 大学学报，2006,21(1) :7-14)。只要具有了这些保守的结构框，那么就可以具有相应的启动 下游基因表达的功能。
[0004]近年来，对启动子的功能研究，大量文献报道采用的方法通常是先用生物信息学 初步预测和分析启动子序列后，再将启动子片段与报告基因融合构建表达载体，转化模式 植物拟南芥、烟草、水稻等，再通过检测报告基因在转基因个体中的表达情况来分析启动子 的功能并加以利用。大量的文献报道显示其他植物的启动子转化到上述植物中均可正常的 行使其生物功能，如：从马铃薯中分离的一个与乙醇脱氢酶非常相似的TDF511(transcriptderivedfragment)基因Stgan的 启动子 ，构建Stgan启动子-GUS融合表达载体转化 烟草，GUS组织化学染色显示该启动子驱动基因在烟草茎结节处特异表达，可能参与块茎形 成过程（TrindadeLM,etal.Isolationandfunctionalcharacterizationofa stolonspecificpromoterfrompotato(SolanumtuberosumL.).Gene,2003,303:77-84.)。在芝麻中克隆的微粒体油酸脱氢酶基因（FAD2)的启动子，此启动子中的E-box和G- box元件与三酰甘油的生物合成有关。在转基因拟南芥和其他转基因植物中也显示出了种 子特异性的表达(MiJungKim,HeejaKim,MiChungSuh.Seed-specificexpressionof sesamemicrosomaloleicaciddesaturaseiscontrolledbycombinatorial propertiesbetweennegativecis-regulatoryelementsintheSeFAD2promoterand enhancersinthe5/-UTRintron.MolecularGeneticsandGenomics.2006,276(4): 351-368)。从玉米中克隆的ZmGLUl基因启动子，连接⑶S报告基因后转化至烟草中，检测分 析结果玉米的ZmGLUl启动子驱动了GUS基因在烟草根部高效表达(Ri1iangGu，LiZhao， GuoyingWang.Isolationofamaizebeta-glucosidasegenepromoterand characterizationofitsactivityintransgenictobacco.PlantCell Reports. 2006，25( 11): 1157-1165)。以上这些报道都是利用转基因技术在不同的植物间进 行启动子功能分析的例子，这些实例表明利用模式植物拟南芥、烟草等作为载体，通过转基 因植株的表达分析证实来自于其他植物的启动子的功能是被广泛认可和接受的。
[0005] 西瓜(CitrulluslanatusMatsum，2n= 22)属萌芦科植物，是世界重要的经济水果 之一。据联合国粮农组织(FA0)统计，全球西瓜种植面积在世界十大果品居第五位，我国西 瓜生产面积、总产量和人均消费量均居世界第一，堪称世界第一西瓜大国。随着转基因技术 的成熟，转基因西瓜必然会面临转基因安全风险的舆论，利用在西瓜果实中完全不表达的 启动子来启动目的基因的表达是解决这个问题的一个可行方法，既能达到既提高西瓜各方 面品质，又不引起食用安全风险的目的。目前还没有对应的西瓜内源启动子。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是要提供一种西瓜C1CP2基因的启动子及其制备方法和应用。该 启动子既能达到既提高西瓜各方面品质，又不引起食用安全风险。
[0007]为实现此目的，本发明所设计的西瓜C1CP2基因的启动子，其特征在于:该西瓜启 动子的序列为SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。
[0008] -种用于获得上述西瓜启动子的引物对，其特征在于:所述引物对为：
[0009]pClCP2FP：5/-(KpnI)CGGGGTACCAAGAGACGACGAATGCCAATA~3'；
[0010] PClCP2RP：5/-(XbaI)CTAGTCTAGATTTCACCGCTAAGAATCGAAG~3/。
[0011] -种上述西瓜C1CP2基因的启动子的制备方法，其特征在于:它包括如下步骤：
[0012] 步骤1:根据西瓜全基因组测序获得的C1CP2基因上游2kb左右序列设计1对引物进 行PCR(聚合酶链式反应，PolymeraseChainReaction,以下相同）扩增，扩增获得西瓜 C1CP2的基因5端上游2kb左右的启动子序列，所用引物为：
[0013]pClCP2FP：5/-(KpnI)CGGGGTACCAAGAGACGACGAATGCCAATA-3 '；
[0014]PClCP2RP:5/-(XbaI)CTAGTCTAGATTTCACCGCTAAGAATCGAAG-37 ；
[0015] 步骤2:根据西瓜全基因组测序获得的C1CP2的基因5'端上游2kb左右的启动子序 列设计所用的引物pCICPSFPd'-(KpnI)CGGGGTACCAAGAGACGACGAATGCCAATA-3 ' ；和 pClCP2RP:5/-(XbaI)CTAGTCTAGATTTCACCGCTAAGAATCGAAG-3'，利用十六烷基三甲基溴化 铵法(CTAB法，HexadecyltrimethyAmmoniumBromide)提取西瓜叶片基因组DNA，以该提取 的DNA为模板进行聚合酶链式反应扩增，得到目的基因5'端上游2014bp的侧翼序列，经过生 物信息学分析此序列为C1CP2基因的启动子全长序列，命名为pClCP2。
[0016] -种上述西瓜C1CP2基因的启动子植物表达载体pBI_pClCP2的制备方法，其特征 在于，它包括如下步骤：
[0017]步骤1:以核苷酸序列为SEQIDNo.1的西瓜启动子为模板设计引物对，且引物对 分另|J添加ΚρηI、XbaI酶切位点：pC1CP2FP: 5'_(ΚρηI)CGGGGTACC AAGAGACGACGAATGCCAATA-S'和pClCP2RP:57-(XbaI)CTAGTCTAGA TTTCACCGCTAAGAATCGAAG-37 ；
[0018]步骤2:以核苷酸序列为SEQIDNo.1的西瓜启动子为模板进行PCR扩增，获得PCR 产物；
[0019] 步骤3:PCR