花青苷调控基因PyMYB10.2及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种植物花青苷调控基因PyMYBlO. 2及 其应用。
【背景技术】
[0002] 花青苷是一类水溶性类黄酮物质，广泛存在于植物中，是叶、花和果实呈色的主要 色素成分。花青苷对植物本身具有重要的生理作用，可以提升植物对盐胁迫、干旱胁迫和紫 外线胁迫的抗性;花瓣和果实中的花青苷可以吸引动物进行授粉和种子传播。除此之外，花 青苷还具有重要的医疗保健功能，可以改善肝功能、预防心血管疾病、抗癌、抗炎、抗氧化和 保护视力等。因此，对花青苷的相关研究，尤其是花青苷的合成调控研究引起了人们极大的 关注，也是目前研究的一个热点。
[0003] 花青苷合成途径是植物中研究最为清楚的次生代谢途径。参与花青苷合成的基因 分为结构基因和调控基因两大类。其中，结构基因编码花青苷合成酶，调控基因编码花青苷 调控蛋白。越来越多的研究表明花青苷的合成主要受转录水平的调控，花青苷结构基因之 间的表达存在一定的协同效应，其表达强度和模式受调控基因的控制。由此可见，调控基因 在花青苷合成中发挥十分关键的作用。因此，发掘和鉴定花青苷调控基因，开展花青苷调控 基因克隆和作用机理等方面的研究，对实现植物花青苷含量的定向改良，具有十分重要的 理论意义和应用价值。
[0004] MYB是植物中最大的一类转录因子，根据含有MYB结构域的个数，可以将其分为R1-MYB，R2R3-MYB和R1R2R3-MYB三类。其中R2R3-MYB是植物中数目最多的一类MYB转录因子，它 们在植物生命活动中发挥重要的作用，如调控细胞分化、形态建成、环境应答和次生代谢 等。自从1987年Paz-Ares首次报道玉米花青苷调控R2R3-MYB转录因子C1以来，相继从拟南 芥、苹果、葡萄等十几种植物中克隆鉴定了花青苷调控R2R3-MYB转录因子，发现这些转录因 子可以单独或与bHLH、WD40形成蛋白复合体共同控制结构基因的时空表达，在花青苷合成 调控中起中心作用。通过基因工程手段，已经将花青苷调控R2R3-MYB转录因子成功应用于 改良花色，提升蔬菜水果中花青苷的含量等作物育种领域。另外，这类基因还可以作为植物 遗传转化的报告基因加以利用。
[0005] 富含花青苷的红梨资源稀少珍贵，鉴于花青苷在呈色和营养保健上的重要功能， 近几年人们提出了梨花青苷含量改良的育种目标。随着国内外红梨新品种的选育和推广， 人们开始了梨花青苷合成调控的基础生物学研究。但是，R2R3-MYB类花青苷调控基因在梨 中的研究还比较少，对该类基因进行挖掘，研究其花青苷调控机理，有利于了解梨花青苷合 成调控的分子基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种花青苷调控基因PyMYBlO. 2,以及其在调控植物花青苷 合成中的应用。本发明所提供的花青苷调控基因来源于梨(Pyrusspp)，具体品种为"早红 酥"，克隆到的基因命名为PyMYB10.2。本发明包括（1)克隆一个花青苷调控基因PyMYB10.2; (2)提供该基因及其编码蛋白的序列；（3)提供将该基因转入烟草或拟南芥中的转基因方 法；（4)提供该基因在调控植物花青苷合成中的应用。
[0007] 一种花青苷调控基因PyMYB10.2,所述调控基因的核苷酸序列如SEQIDN0:1所 不。
[0008] 应当理解，本领域人员可根据本发明公开的花青苷调控基因PyMYBlO. 2的核苷酸 序列（SEQIDN0:1)，在保证其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，得 到该基因的突变序列。因此，本发明的花青苷调控基因PyMYBlO.2还包括SEQIDNO: 1所示 的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸残基，具有与花青苷调控基因 PyMYB10.2编码的蛋白相同活性的由PyMYB10.2衍生得到的基因。SEQIDNO: 1所示的核苷 酸序列是由855个核苷酸组成的基因。
[0009]本发明还提供上述编码权利要求所述的PyMYBlO. 2基因编码的蛋白。所述蛋白的 氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0010] SEQIDN0:2所示的氨基酸序列是由284个氨基酸残基组成的蛋白质。
[0011] 含有权利要求1所述基因的重组质粒。
[0012] 可选的，如上所述的重组质粒，所述质粒为pMD18-T、pBI121或pGreenII62-SK。
[0013] 本发明的一个实施例中，将核苷酸序列为SEQIDNO: 1的基因片段链接到克隆载 体PMD-18T中；再通过限制酶剪切并连接到表达载体pBI121中构建重组质粒。
[0014]含有权利要求3或4所述重组质粒的宿主细胞。
[0015]可选的，所述宿主细胞为大肠杆菌和农杆菌GV3101。
[0016]-种将权利要求1中所述基因转入烟草中的转基因方法，包括以下步骤：
[0017] 1)、提取梨总基因组DNA作为模板，以SEQIDN0:3、SEQIDN0:4所示核苷酸序列 的引物进行扩增；
[0018] 2)、将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO: 1的基因片段定向克隆 到pGreenII62-SK上，得到重组质粒；
[0019] 3)、将所述重组质粒转化至农杆菌GV3101后用所述农杆菌GV3101对烟草进行侵染 转化，得到转基因烟草。
[0020] -种将权利要求1中所述基因转入拟南芥中的转基因方法，包括以下步骤：
[0021] 1)、提取梨总基因组DNA作为模板，以SEQIDN0:3、SEQIDN0:4所示核苷酸序列 的引物进行扩增；
[0022]2)、将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO: 1的基因片段定向克隆 到PBI121上，得到重组质粒；
[0023]3)、将所述重组质粒转化至农杆菌GV3101中，随后用所述农杆菌GV3101对拟南芥 进行侵染转化，得到转基因拟南芥。
[0024]可选的，如上所述的拟南芥转基因方法，步骤2)具体包括：
[0025]将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO: 1的基因片段定向克隆到PMD18-T克隆载体中，对所述克隆载体进行扩增;将PyMYBlO. 2基因片段从克隆载体上酶切 下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的表达载体PBI121上，得到重组质粒。
[0026]本申请先将目的片段连接到克隆载体上，再酶切并与表达载体连接。此操作有主 要两方面的原因：
[0027]进克隆载体比进表达载体容易很多，可以尽快拿到目的片段，一旦克隆不成功，或 者因为Taq酶的错配出现了碱基突变，会需要重复几次，样本即耗材都会大量消耗；
[0028]克隆载体的最大优点是它一般都有成熟的筛选系统，这样在一些连接效率较低、 特异性不强的时候容易筛选。
[0029]同时可选的，对所述克隆载体进行扩增时，所用的宿主细胞为大肠杆菌DH5a。
[0030] 权利要求1所述的基因在调控植物花青苷合成中的应用。
[0031] 本领域技术人员可知，基于此应用可拓展出其他应用，如开展花青苷调控基因克 隆和作用机理等方面的研究，对实现植物花青苷含量的定向改良、改良花色、提升蔬菜水果 中花青苷的含量、作为植物遗传转化的报告基因等等。
[0032]所述植物可以为烟草和拟南芥，但本申请所述的应用范围包括不仅限于这两种植 物。
[0033] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0034] 1)、R2R3_MYB类花青苷调控基因在梨中的研究还比较少，本发明提供了一种植物 花青苷调控基因PyMYBlO. 2，该基因与已知调控转录因子的同源性均低于50%，和bHLH转录 因子在调控花青苷结构基因的表达过程中存在协同效应，可为相关研究提供新的思路。
[0035] 2)、本申请提供的应用在关于花青苷的科研和农业研究中具有深入挖掘的前景。 可在本申请提供的转基因方法和应用的基础上，进一步进行改良花色、作为植物遗传转化 的报告基因、提升蔬菜水果中花青苷的含量等应用。大大增加了花青苷的应用前景。
【附图说明】
[0036] 图1为构建的PyMYB10.2与其它R2R3-MYB转录因子的进化树；
[0037]图2为PyMYB10.2对花青苷结构基因AtDFR启动子的调控活性的统计结果，纵坐标 为焚火虫焚光素酶(firefly luc if erase)和海肾萤光素酶(reni 11a lucif erase)活性比 值；
[0038]图3为瞬时表达烟草的表型观察示意图；叶片上的深灰色斑点为侵染激活载体农 杆菌的烟草温室培养8天后形成的大量花青苷积累。
【具体实施方式】
[0039]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，