葡萄糖氧化酶基因god、利用其编码的蛋白、转化的巴斯德毕赤酵母及其制备
【技术领域】
[0001] 本发明属于新基因的制备，特别是指一种葡萄糖氧化酶基因G0D、利用其编码的蛋 白以及转化的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖氧化酶（EC1. 1. 3. 4)是一种能够专一的催化β-D-葡萄糖氧化为δ-D-葡 萄糖酸，并且利用分子氧作为受体产生过氧化氢的需氧脱氢酶。葡萄糖氧化酶是国家允许 使用的酶制剂之一，对人体无毒、无副用作，具有去除葡萄糖、脱氢、杀菌等功效，已被广泛 应用于食品、纺织、化工、饲料、医药等行业中。
[0003] 葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物及微生物体内，目前用于研究及生产葡萄糖氧化 酶的主要菌株为黑曲霉（Abperrillusniger)和点青霉（Penicilliumnotatum)，这是因为 霉菌产酶能力强，易于规模化生成；但黑曲霉和青霉菌发酵生产G0D过程中，过氧化氢酶、 纤维素酶及淀粉酶等大量杂酶的存在给纯化带来相当的困难。近几年市场对葡萄糖氧化酶 的需求量逐年增长。但我国葡萄糖氧化酶技术水平尚处于研究发展的初级阶段，存在产量 低、酶活低、提纯繁琐、酶活检测方法操作复杂等问题，使国内葡萄糖氧化酶仍以进口为主。 并且传统以优化发酵条件提高葡萄糖氧化产量和酶活的方法，存在着精确度低、实验次数 多、周期长、不能快速有效地提高葡萄糖氧化酶的产量和酶活的技术缺陷。
[0004] 重组葡萄糖氧化酶基因进行异源表达可有效地解决这些问题，尤其是毕赤酵母表 达外源蛋白具有表达量高、稳定性好、培养成本低和产物易分离纯化等优点，适于大体积高 密度连续发酵，具有强且易控的醇氧化酶（Alcohol〇xidaSe，A0X)启动子等优点，可严格控 制外源基因的表达。
[0005] 通过基因工程手段改造葡萄糖氧化酶生产菌株，获得萄糖氧化酶准确高效的生产 和提取方法，提高产酶量，为后期的工业化生产提供了导向基础，提高其经济效益。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种葡萄糖氧化酶基因G0D。
[0007] 本发明的目的之二在于提供一种葡萄糖氧化酶基因GOD的制备方法。
[0008] 本发明的目的之三在于提供一种利用葡萄糖氧化酶基因G0D编码的蛋白。
[0009] 本发明的目的之四在于提供一种利用葡萄糖氧化酶基因G0D转化巴斯德毕赤酵 母Pichia pastoris的方法。
[0010] 本发明的整体技术构思是：
[0011] 葡萄糖氧化酶基因G0D，其基因序列为SEQIDNo. 1。
[0012] 葡萄糖氧化酶基因GOD的制备方法，是以Y端ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA和 3 ^端CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA为特异引物，以点青霉DNA为模板，采用PCR扩增方法 获得。
[0013] 利用萄萄糖氧化酶基因GOD编码的蛋白，其序列为SEQIDNo. 2。
[0014] 利用葡萄糖氧化酶基因GOD转化的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，其保藏编 号为CGMCCNo. 11626。
[0015] 本发明中的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris申请人已于2015年11月6日提交 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo. 11626,该保 藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机 构的简称为CGMCC。
[0016] 利用葡萄糖氧化酶基因GOD转化的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris的制备方 法，其制备方法中的步骤如下：
[0017]A、通过PCR方法设计引物将点青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码 序列去除，引物序列如下：GodF: 5 'GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCTATAGCCCGGCCGAGCAGATCG AC3'，序列中下划线部分为上游引物添加限制性内切酶EcoRI识别位点；G〇dR:5<GAGATG AGTTTTTGTTCTAGAGCGGCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC3 '，序列中下划线部分为下游添加 限制性内切酶Notl识别位点；
[0018]B、PCR产物经纯化回收采GIBSON连接到表达载体pMD-AOX的EcoRI和Notl位点 上，转化到E.coliDH5a，酶切验证筛选阳性克隆，并送测序；
[0019]C、测序正确重组质粒pMD-A0X-G0D经Pmel酶切后线性化。用2μg线性化 pMD-AOX-GOD质粒电击转化80μ1毕赤酵母PichiapastorisX33感受态细胞，然后将 转化细胞涂于含100μg/mlG418的YPD平板上，30°C培养96h;随机挑选阳性菌落转接含 100μg/mLG418的液体YPCS培养基，在温度30°C、转速200r/min条件下振荡培养3d，期间 每隔24h加1%的甲醇，测定发酵液上清中的葡萄糖氧化酶活性。
[0020] 本发明的具体技术内容还有：
[0021] 所述的葡萄糖氧化酶基因G0D的制备方法中是利用所设计的特异性引物，以点 青霉DNA为模板，在扩增仪上按照98°C预变性5分钟；30个PCR循环：98°C变性30秒， 65°C退火30秒，72°C延伸1分钟；72°C延伸10分钟的程序进行PCR扩增；PCR反应均按 如下成份及用量进行：反应体系为50μ1:基因组DNA100ng，引物各0. 2ymol/L，dNTPs 250μmol/L, 5XQ5High-FidelityDNAPolymeraseBuffer10μ1,Q5High-Fidelity DNAPolymerase0. 5μ1。PCR产物跑1 %的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物通过T4DNA连 接酶连接到质粒PMD18-T载体上，并转化大肠杆菌DH5α，然后涂布到具有氨苄青霉素的LB 平板上，37°C过夜培养直至菌落长出，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得G0D基因 序列。
[0022] 本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
[0023]1、本发明通过PCR技术获得了一个全长的G0D基因序列，该基因全长为1815bp，GC 含量为55. 4%。同源分析该基因与以往的报道的GOD的基因序列具有一定的差异，证明该 基因是一个新的G0D基因。
[0024] 2、本发明中所制备的巴斯德毕赤酵母PichiapastorisCGMCCNo. 11626突破了 传统黑曲霉和青霉菌发酵生产GOD过程中，夹杂大量过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶等杂 酶，难纯化的问题。利用本发明所获得的转基因毕赤酵母工程菌，在10L发酵罐水平检测条 件下，甲醇诱导144小时，发酵液中的酶活达到594U/ml，显著提高了发酵酶活；并且通过基 因工程手段改造葡萄糖氧化酶生产菌株，还可以获得萄糖氧化酶准确高效的生产，提高产 酶量（9g/L)，为后期的工业化生产提供了导向基础，提高经济效益。
[0025]本发明中的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris申请人已提交中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.11626,该保藏机构的地址位于北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机构的简称为CGMCC。
【附图说明】
[0026] 本发明的附图有：
[0027] 图1是本发明中葡萄糖氧化酶基因G0D及利用其编码的蛋白的序列表。
[0028] 图2点青霉G0D基因全长结果。
[0029] 以点青霉基因组DNA为模板，引物P1和P2进行PCR扩增，扩增出现一条约1800bp 的特异带，。序列分析结果表明，其基因组DNA长1815bp，GC含量为55. 4%，含有全长的GOD 基因片段。Μ为DNAMarker，分子量从大到小依次为10000,8000,6000, 5000,4000, 3000bp， 2000bp，1000bp;1和2为GOD基因扩增产物。
[0030] 图3是表达质粒pMD-A0X-G0D双酶切检测结果。
[0031] 将经引物GodF和GodF进行PCR扩增并纯化回收的点青霉G0D基因和经过EcoRI 和Notl双酶切的载体pMD-AOX进行Gibson连接以构建重组质粒。用重组质粒转化感受态 大肠杆菌DH5α，并在含Amp的LB平板上筛选阳性菌落。阳性菌落质粒经EcoRI和Notl 双酶切后，得到约6.5.Okb和1.8kb的两个DNA片段，亦与预期大小相符。图中Μ为DNA Marker，分子量从大到小依次为 10000,8000,6000, 5000,4000, 3000bp，2000bp，1000bp，1-6 是表达质粒PMD-A0X-G0D双酶切产物。
[0032] 图4是葡萄糖氧化酶在YPCS的表达的SDS-PAGE检测结果。
[0033] 将重组的表达质粒pMD-A0X-G0D经Pmel酶切后线性化后，电转化毕赤酵母X33感 受态，在Yro平板生长3d后，随机挑选阳性菌落转接液体YPCS，经甲醇诱导72h后，测定发 酵液上清中的葡萄糖氧化酶活性，从32个转化子中挑选出6株有葡萄糖氧化酶活性的转化 子，表达率为16. 7%。同时发酵液上清液做蛋白质SDS-PAGE电泳，可见一条浓染的约90kD 的蛋白条带。图中Μ为是蛋白Marker，1-8筛选的不同毕赤酵母菌株，其中5号菌株酶活最 尚，24U/ml。
[0034] 图5是葡萄糖氧化酶在10L发酵罐的表达SDS-PAGE检测结果。
[0035] 在10L发酵罐中，在甲醇未诱导之前，处于菌株培养和碳源饲喂阶段，在这两个阶 段内，菌体大量增长，此时无葡萄糖氧化酶蛋白的表达。随着甲醇的诱导，发酵液中的葡 萄糖氧化酶活性逐渐增加，诱导144h后发酵液中葡萄糖氧化酶活性为496U/ml，蛋白质表 达量达到9. 4g，SDS-PAGE同时表明发酵液中葡萄糖氧化酶蛋白表达量也在不断积累。图 中Μ为是蛋白Marker，1-12 为经甲醇诱导 0h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，108h，120h， 132h，144h葡萄糖氧化酶表达量。