AtMAPKKK18基因提高植物干旱抗性的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及AtMAPKKK18基因提高植物干 旱抗性的应用。
【背景技术】
[0002] 植物体在其生长发育过程中，会受到各种外界环境的影响，包括生物胁迫或者非 生物胁迫，而干旱胁迫是其中最重要的非生物胁迫之一。近年来，随着全球气候的剧烈变 化，干旱已经成为了一个全球性问题，干旱胁迫对植物体的影响主要表现在三个方面：一是 破坏植物膜系统，破坏内膜系统的区室化，同时使得一些膜结合的酶丧失活性，从而使细胞 的正常代谢发生紊乱；二是影响植物的光合作用，干旱缺水会造成气孔关闭，使得C02的吸 收量降低，光合速率下降；三是抑制植物的生长发育，因为植物细胞的含水量高达80%，而 水分又是一切酶促反应的介质，因此水分减少必然会降低植物的代谢活动，同时水分减少 还会增强植物的呼吸作用，加速体内物质分解，从而导致作物减产。因此，研究植物的抗旱 机理，发掘植物体内的抗旱相关基因对于提高植物的抗旱性、提高作物产量以及培育抗旱 作物新品种等均具有重要的理论和应用价值。
[0003] 本发明人从拟南芥中分离到丝裂原活化蛋白激酶基因AtMAPKKK18的CDNA序列。 进一步构建CaMV35S启动子驱动的AtMAPKKK18的植物表达载体，转化拟南芥。获得的超表 达转基因拟南芥与野生型拟南芥相比抗旱能力明显提升；而突变体的抗旱能力与野生型相 比是减弱的。对转基因拟南芥、野生型和突变体的失水率进行检测发现转基因拟南芥的失 水率是最小的，而突变体的失水率是最大的。脱落酸（ΑΒΑ)处理后转基因拟南芥的气孔开 度也是最小的。因此AtMAPKKK18基因可用于植物抗逆基因工程，改善植物的抗旱能力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种拟南芥基因AtMAPKKK18,将其连接到CaMV35S启动子 驱动的植物表达载体上，利用脓杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，获得的转基因植株抗 旱能力得到了大大提升。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] 本发明从拟南芥中通过PCR的方法克隆得到AtMAPKKK18基因，插入到植物表达载 体PBI121中CaMV35S启动子的下游，转化植株，获得超表达转基因植株。
[0007] 上述所述的PCR引物为：
[0008] 5'：TCTAGAGTATCATTCTCCAAATGAATTGG
[0009] 3,：GAGCTCCTAATTCCGTCGAACCGTG
[0010] 反应体系为：
[0011] PCR扩增体系为25μL，具体成分如下。
[0012]
[0014] 反应步骤为：预变性：94°C5min;
[0015] 循环条件：94°C30s，55°C30s，72°Clmin;
[0016] 循环35次；
[0017] 后延伸：72°ClOmin。
[0018] 所述的AtMAPKKK18基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0019] 所述的AtMAPKKK18基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0020] 一种含有AtMAPKKK18基因的重组载体为将所述的AtMAPKKK18基因插入植物表达 载体PBI121中CaMV35S启动子的下游所得到的表达载体。
[0021] 本发明所述的AtMAPKKK18基因通过所述的含有AtMAPKKK18基因的重组载体导入 目的植物中。
[0022] 本发明提供了AtMAPKKK18基因在转基因植株抗旱上的应用，所得到的转基因株 系抗旱能力明显增强。
[0023] 本发明还提供了含有AtMAPKKKlS基因的重组载体在转基因植株抗旱上的应用。
[0024] 本发明所述拟南芥蛋白AtMAPKKK18基因的转基因实验证明，该基因参与调控植 物的生长发育和胁迫应答等过程，从而为植物品种的改良提供了一个优质基因。表达拟南 芥中的AtMAPKKK18基因能够提高植物的抗旱能力。
【附图说明】
[0025] 图1是AtMAPKKK18基因的扩增产物电泳图；
[0026] 图2是AtMAPKKK18基因克隆载体电泳图；1、2、3号泳道菌斑均为阳性克隆，4号泳 道为PCR阳性对照；
[0027] 图3是AtMAPKKK18基因克隆载体和pBI121载体的酶切电泳；
[0028] 图4是转化有AtMAPKKK18的阳性菌斑的表达载体；1、3号泳道为阳性克隆，4号泳 道为阳性对照；
[0029] 图5是双酶切表达载体质粒电泳；
[0030] 图6是4丨獻?1?1(18表达载体转化农杆菌6￥3101菌液？〇?检测电泳；2、7、8号泳 道为阳性克隆，9号泳道为阳性对照；
[0031] 图7是六七獻?1?1(18超表达转基因阳性苗鉴定；1、2、4、5、6、7、8、9为阳性苗 ；
[0032] 图8是AtMAPKKK18超表达转基因纯合体株系表达量的鉴定；
[0033] 图9是T-DNA插入示意图；
[0034] 图10是AtMAPKKK18T-DNA插入突变体的鉴定；
[0035] 图11是突变体表达量的鉴定；
[0036] 图12是野生型、超表达株系和突变体的存活率统计图；
[0037] 图13是AtMAPKKK18超表达株系和突变体的失水率统计折线图。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0039] 实施例lAtMAPKKK18基因的分离鉴定
[0040] 1、TRIZ0L法提取拟南芥总RNA，方法如下：
[0041] (1)在1. 5mL离心管中加入lmLTrizol提取液；
[0042](2)加入0·lg液氮研磨的材料，混匀，室温放置5min后，4°C，12000g离心lOmin;
[0043] (3)取上清，加0.2mL氯仿，剧烈摇动15s，室温放置2-311^11，4°(：，1200(^离心 15min；
[0044](4)取水相，加0· 5mL异丙醇，室温放置lOmin，4°C，12000g离心lOmin，取沉淀；
[0045] (5)用75%冷乙醇洗涤沉淀，4°(：，750(^离心51^11 ;
[0046] (6)去上清，沉淀干燥后用50μLDEPC-H20溶解，电泳或者测定吸光度检测RNA质 量，-80°C保存。
[0047]2、总RNA中基因组DNA的去除
[0048]
[0049] 42°C反应 2min。
[0050] 3、RNA的反转录
[0051]
[0052] 37°C反应 15min，85°C反应 5sec，得反转录cDNA。
[0053] 基因组去除及RNA反转录试剂均购自TAKARA公司。
[0054] 4、AtMAPKKK18基因的扩增
[0055] (1)扩增引物为：
[0056] 3K18-5? ：TCTAGAATGAATTGGACTAGAGGAAAAACTTTAG
[0057] 3K18-3, ：GAGCTCCTAATTCCGTCGAACCGTG
[0058] 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。
[0059] (2)扩增体系为：
[0060]
[0061] r-Taq酶，dNTP购自TAKARA公司。
[0062] (3)扩增条件为：
[0063] 预变性：94°C5min;
[0064] 循环条件：94°C30s，55°C30s，72°Clmin;循环 35 次；
[0065] 后延伸：72°ClOmin。
[0066] (4)反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带，并切胶回收扩增得到的 1020bp的AtMAPKKK18全长序列（图1)，用于后续实验。
[0067] 实施例2转基因株系的获得
[0068] 1、AtMAPKKK18克隆载体的构建
[0069] (1)将回收的AtMAPKKK18序列片段连接pMD19-Tsimple载体，插入片段与载体的 摩尔数比为3:1。连接反应体系为：
[0070]
[0071] 将反应体系混匀，16