慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法

文档序号:9661495阅读:1034来源:国知局
慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种慢病毒表达载体及其制备方法和应 用、重组慢病毒的制备方法。
【背景技术】
[0002] 基因表达是细胞在生命过程中,把储存在DNA序列中的遗传信息经过转录和翻 译,转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程。通过基因工程可以实现外源基因在生物细 胞甚至生物体内的表达,从而达到人为调控细胞或实物体性状的目的。
[0003] 真核细胞,尤其是哺乳动物细胞的外源基因的导入,主要通过物理方法、化学方法 或生物学方法完成。物理方法主要包括DNA显微注射法、电穿孔法和金属颗粒轰击法等方 法;化学方法主要包括脂质体介导和受体介导等方法;生物学方法主要是通过各种病毒实 现,如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒等。物理方法和化学方法可以负载大量外源 基因片段,并且有部分方法可以实现将外源基因插入到细胞或生物体的基因组中,但总体 来说,通过这两类方法实现外源基因表达的效率不高,而且大多数时候无法很好地实现外 源基因插入细胞或生物体基因组,进而无法实现外源基因的稳定永久表达。生物学方法中 的腺相关病毒、慢病毒等方法则可以很好地实现这一目标,它们可以将外源基因整合到细 胞或生物体的基因组中,从而实现外源基因的稳定永久表达。其中,慢病毒以其具有可以感 染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段更大等优点受到科学界的青睐。
[0004] 目前,不管是在实验室还是在产业界,慢病毒的应用都非常广泛。随着应用领域的 不断扩大,对慢病毒的要求也在不断提高。当前,在科研和实际运用中,通过慢病毒一次导 入两个基因并实现其高效表达的需求也越来越大,例如2013年《Science》杂志评选出的十 大科学突破之首一癌症免疫疗法,包括TCR-T等技术。由于TCR-T技术能够表达特异性受 体靶向识别特异性的细胞如肿瘤细胞,受到广泛的关注和研究,并从初期的基础免疫研究 转变为现在的临床应用。由于TCR-T技术需要将T细胞受体(TCR)两个亚基对应的DNA序 列同时导入到T细胞中,因此其对能实现双基因快速导入技术的需求非常迫切,而现有的 慢病毒载体尚不能很好地满足这一需求。
[0005] 当前的慢病毒技术主要通过两种方式实现双基因的导入:在慢病毒载体的基因表 达区构建双启动子或一个启动子+ -个内部核糖体进入位点序列(IRES),通过两个启动 元件在转录水平实现两个外源基因的表达。这两种方式均可以实现双基因的表达,但存在 以下两个主要的缺点:1、位于载体上游和下游基因的表达水平不一致。由于不同启动元件 效率的不同以及两者之间可能存在的相互作用,从而导致上下游基因的表达水平差异很大 (如10倍的差异),甚至出现其中一个基因不表达的情况;2、慢病毒对外源基因的负载容量 一般在8000bp~lOOOObp左右,而启动元件的大小一般在500bp~700bp左右。可以看到, 单个启动元件占慢病毒负载容量的比例接近10%,因此多引入一个启动元件就意味着通过 慢病毒导入的外源基因序列,就意味着可用于导入外源基因容量的减少。因此使用这两种 方式实现的慢病毒双基因表达均不是特别理想。现有技术中尚无可解决以上问题的慢病毒 载体。

【发明内容】

[0006] 基于此,有必要提供一种双基因表达效果较好的慢病毒表达载体及其制备方法和 应用、重组慢病毒的制备方法。
[0007] 一种慢病毒表达载体,所述慢病毒表达载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual_Casp9. WPRE载体,所述pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual-Casp9.WPRE载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP. WPRE载体的GFP序列被替换为带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9得到;
[0008] 所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9包括从5'到3'端依次排列的 如下结构:第一多克隆位点-第一弗林蛋白酶切割位点-V5标签-第一Spacer-第一 2A 肽-Casp9_第二多克隆位点,其中,代表连接;
[0009] 所述Casp9包括从5'到3'端依次排列的如下结构:iCasp9_第二弗林蛋白酶切 割位点-第二Spacer-第二2A肽。
[0010] 在一个实施例中,所述iCasp9的序列如SEQIDNo.1所示。
[0011] 在一个实施例中,所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的序列如SEQ IDNo. 2 所示。
[0012] 在一个实施例中,所述第一多克隆位点的序列如SEQIDNo. 3所示;
[0013] 所述第二多克隆位点的序列如SEQIDNo. 4所示;
[0014] 所述第一弗林蛋白酶切割位点和所述第二弗林蛋白酶切割位点的序列均如SEQ IDNo. 5 所示;
[0015] 所述V5标签的序列如SEQIDNo. 6所示;
[0016] 所述第一Spacer和所述第二Spacer的序列如SEQIDNo. 7所示;
[0017] 所述第一 2A肽和所述第二2A肽的序列选自SEQIDNo. 8所示的序列、SEQID No. 9所示的序列、SEQIDNo. 10所示的序列和SEQIDNo. 11所示的序列中的一种,所述第 一 2A肽和所述第二2A肽的序列彼此不同。
[0018] 在一个实施例中,所述第一多克隆位点插入有第一目的基因,所述第二多克隆位 点插入有第二目的基因;
[0019] 所述第一目的基因为小鼠TCRa基因,所述小鼠TCRa基因的NCBI编号为 DQ452619,所述第二目的基因为小鼠TCRβ,所述小鼠TCRβ基因的NCBI编号为DQ452620。
[0020] 一种上述的慢病毒表达载体的制备方法,包括如下步骤:
[0021] 设计带有自杀开关的双基因表达盒子Dual_Casp9,并委托合成所述带有自杀开 关的双基因表达盒子Dual-Casp9,得到含有pUC-Dual-Casp9质粒的大肠杆菌菌液,所述 pUC-Dual-Casp9质粒中含有所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9,所述带有 自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9包括从5'到3'端依次排列的如下结构:第一多克 隆位点-第一弗林蛋白酶切割位点-V5标签-第一Spacer-第一 2A肽-Casp9-第二多克隆 位点,其中,代表连接,所述Casp9包括从5'到3'端依次排列的如下结构:iCasp9-第 二弗林蛋白酶切割位点-第二Spacer-第二2A肽;
[0022] 将所述含有pUC-Dual-Casp9质粒的大肠杆菌菌液跟选择性LB液体培养基混合, 在37°C恒温摇床中300rpm培养12h~16h至0D6。。为0. 6~0. 8,将得到的菌液离心后保 留第一沉淀,将所述第一沉淀裂解后提取所述pUC-Dual-Casp9质粒;
[0023] 在37°C下用Asc I内切酶和Sal I内切酶处理pUC-Dual_Casp9质粒,充分反应后 回收,得到所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段;
[0024]在 37°C下用AscI内切酶和SalI内切酶处理pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载 体,将所述pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列切除,充分反应后回收,得到线性 化的pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体;
[0025] 按照摩尔比为3~10 :1将所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual_Casp9的片 段与所述线性化pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体混合,再加入T4DNA连接酶,4°C下连接 过夜,得到含有连接质粒的连接产物;以及
[0026] 将所述含有连接质粒的连接产物转化感受态ToplO大肠杆菌,并均匀涂布到选择 性的LB平板上,37°C倒置培养12h~16h,挑取阳性菌落置于所述选择性LB液体培养基中, 在37°C恒温摇床中300rpm培养12h~16h至0D6。。为0. 6~0. 8,将得到的菌液离心后保 留第二沉淀,将所述第二沉淀裂解后提取所述连接质粒,所述连接质粒即为所述慢病毒表 达载体。
[0027] 在一个实施例中,还包括在得到所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual_Casp9 的片段之后,在所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段的所述第一多克 隆位点插入第一目的基因,在所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段的 所述第二多克隆位点插入第二目的基因的操作;
[0028] 所述第一目的基因为小鼠TCRa基因,所述小鼠TCRa基因的NCBI编号为 DQ452619,所述第二目的基因为小鼠TCRi3基因,所述小鼠TCRi3基因的NCBI编号为 DQ452620。
[0029] -种慢病毒表达试剂盒,包括上述的慢病毒表达载体。
[0030] 一种重组慢病毒的制备方法,包括如下步骤:
[0031] 提供上述的慢病毒表达载体,并在所述带有自杀开关的双基因表达盒子 Dual-Casp9的片段的所述第一多克隆位点插入第一目的基因,在所述带有自杀开关的双基 因
当前第1页1 2 3 4 5 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1