一种利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米砸的方法。
【背景技术】
[0002]砸是必要的微量元素，对生物体的健康具有很大的重要性。砸是砸蛋白的重要组成部分，在其结构和酶中充当重要的角色，作为一种抗氧化剂和催化剂生成的活跃甲状腺激素就是最好的例子。在人体中，砸能促进免疫系统的正常运行、有效抑制艾滋病毒的扩增，同时还可以增强精子活力、提高繁殖性能、降低流产的概率以及抗癌作用。砸缺乏通常容易使身体进入不良情绪状态，从而易患疾病和感染病毒。
[0003]人体的砸主要来自于动植物食品，而我国72%的土壤缺砸(彡0.6mg/kg)，属严重缺砸的国家，人们从日常饮食中摄入的砸比较少，容易引起克山病等疾病，因此需要额外补充砸来满足人类健康需求。
[0004]在自然界中，砸主要以三种形态存在，无机砸(如亚砸酸钠)、有机砸(麦芽砸、砸酵母等)和纳米砸(粒径在5-200nm的零价砸)，但它们的生物活性和生理毒性并存，在补充砸时需要综合考虑活性与毒性的因素。在急性毒性(LD50)标准方面，无机砸为15mg/kg，有机砸为30-40 mg/kg，纳米砸则高达113 mg/kg。在亚慢毒性方面，饲料中无机砸或有机砸的含量在4-5 mg/kg时即可导致大鼠体重下降和肝硬化，而纳米砸含量在6 mg/kg时也不会出现上述现象。在生物功效方面，纳米砸体外清除羟基自由基的效率为无机砸的5倍，为有机砸的25倍。因此，纳米砸成为替代其他形式砸营养制剂或药剂的最佳选择。
[0005]纳米砸有红色、黑色和褐色三种形态，只有红色纳米砸才有生理活性。目前纳米砸的生产方法主要有化学合成法和生物合成法，生物的纳米砸比化学合成的纳米砸更均匀，形态更规则，且生物合成的纳米砸耐高温，更稳定，不易转化成黑色或褐色纳米砸。生物合成纳米砸主要利用微生物还原亚砸酸盐产生，目前已经报道的菌种有固氮红细菌(Rhodoac ter azo toformans)、乳酸菌(Zac tobacillus)、芽抱杆菌(Bacillus')、大肠杆菌{Escherichia cWi)等。但是由于大多数微生物不易发酵生产、不易保存的特性，不能实现工业化生产。芽孢杆菌由于能产生抗逆性比较强的芽孢，能耐生产加工过程中的不良环境和条件，加上易于保存，是工业化生产纳米砸的良好微生物菌种。但现有报道中提到的芽孢杆菌对亚砸酸盐耐受能力不高，也不利于工业化生产。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种生产性能好、能耐高浓度亚砸酸盐且能高效转化亚砸酸盐生成红色活性纳米砸的芽孢杆菌及利用其生物合成纳米砸的方法。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案来实现:一种利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米砸的方法，它包括以下步骤: 51.斜面种子培养:将地衣芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基斜面上，在28?45°C培养36?48h，得斜面种；
52.一级种子培养:将斜面种接种于液体发酵培养基中，1L三角瓶中装有液体发酵培养基100ml，28?45°C振动培养12?18h，得一级液体种；
53.二级种子培养:将一级液体种接种至300L液体发酵灌中，所述液体发酵灌装有210L液体发酵培养基，28?45°C振动培养培养12?18h，得二级液体种；
54.发酵生产:将二级液体种接种至2T液体发酵灌中，所述液体发酵灌装有1.4T液体发酵培养基，28?45°C振动培养培养18?36h，得纳米砸；
其中，所述液体发酵培养基由下述浓度的原料制备而成:鱼粉?10g/L，酵母粉:1?5g/L，大米粉:1?5g/L，七水合硫酸镁:0.1?0.5g/L，磷酸二氢钾:0.1?lg/L，氯化钠:0.1?0.5g/L，氯化钾:0.1?0.5g/L，碳酸I丐:0.1?lg/L,亚砸酸钠:500mg/L，pH值为 7.2 ?7.4。
[0008]进一步地，所述地衣芽孢杆菌购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCCL 6510。
[0009]进一步地，步骤S1所述的营养琼脂培养基由下述浓度的原料制备而成:牛肉膏:2?5g/L，蛋白胨:8?15 g/L，氯化钠:3?7g/L，琼脂:12?18 g/L，pH值为7.0?7.2。
[0010]进一步地，所述振荡培养的速率为180?220rpm。
[0011]本发明具有以下优点:
1.本发明选用的地衣芽孢杆菌，能耐高浓度的亚砸酸盐，之前报道的使用菌种一般耐受浓度为170mg/L左右，而本发明选用的地衣芽孢杆菌最适亚砸酸钠浓度为500mg/L，最高能耐2000mg/L的亚砸酸钠，而且转化亚砸酸钠成红色活性纳米砸的效率很高，能达到80%以上，因此，本发明能保证一次性生产出大量的纳米砸，降低了生产成本；
2.本发明选用的地衣芽孢杆菌，其菌种属于益生菌，使用安全，农业部《饲料添加剂品种目录(2010)》规定可直接作为饲料添加剂添加到畜禽饲料里面，用这种菌种生产出来的纳米砸饲喂畜禽可生产出富砸肉食品供人类食用；
3.本发明选用的地衣芽孢杆菌，其培养时所需培养基和培养条件要求简单，培养成本低，且利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米砸的方法具有操作简单、制备方便等优点，适用于工业化大规模生产。
【附图说明】
[0012]图1为本发明方法制备的纳米砸形态图，放大倍数为3000倍；
图2为本发明方法制备的纳米砸形态图，放大倍数为5000倍。
【具体实施方式】
[0013]下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
[0014]实施例1:一种利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米砸的方法，它包括以下步骤:
S1.斜面种子培养:将地衣芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基斜面上，在28°C培养36h，得斜面种；营养琼脂培养基由下述浓度的原料制备而成:牛肉膏:2g/L，蛋白胨:8 g/L，氯化钠:3g/L，琼脂:12 g/L, pH 值为 7.Ο ;
52.一级种子培养:将斜面种接种于液体发酵培养基中，1L三角瓶中装有液体发酵培养基100ml，28°C振动培养12h，振荡培养的速率为180rpm，得一级液体种；
53.二级种子培养:将一级液体种接种至300L液体发酵灌中，所述液体发酵灌装有210L液体发酵培养基，28°C振动培养培养12h，振荡培养的速率为180rpm，得二级液体种；
54.发酵生产:将二级液体种接种至2T液体发酵灌中，所述液体发酵灌装有1.4T液体发酵培养基，28°C振动培养培养18h，振荡培养的速率为180rpm，得纳米砸；对产物进行有效活菌数计数，菌浓度可达到120亿/mL。亚砸酸钠转化成纳米砸效率为85%。
[0015]其中，所述液体发酵培养基由下述浓度的原料制备而成:鱼粉:lg/L，酵母粉:lg/L，大米粉:lg/L，七水合硫酸镁:0.lg/L,磷酸二氢钾:0.lg/L,氯化钠:0.lg/L,氯化钾:0.lg/L，碳酸I丐:0.lg/L，亚砸酸钠:500mg/L，pH 值为 7.2。
[0016]实施例2:—种利用地