胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法

文档序号:9661539阅读:769来源:国知局
胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白工程技术领域,具体涉及一种胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方 法。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白又称胶原,是胞外基质中的基本蛋白成分,广泛分布于人体各个器官和 组织,如皮肤,血管、骨骼和软骨等,尤其在人体的皮肤和结缔组织中,含有大量的胶原蛋 白,皮肤细胞外基质中约70 % -80 %为胶原蛋白,其在人体的总含量约占人体蛋白质总量的 25%-33%,这些蛋白质对维护细胞、组织、器官的正常生理功能有非常重要的作用。胶原蛋 白具有非常复杂的特殊超螺旋结构,由Gly-X-Pro为基本重复体构成左手螺旋,X为其他氨 基酸残基,缺乏色氨酸,胶原分子呈纤维状,由三条肽链拧成,三条肽链均无链内氢键,仅受 链间氢键支撑。胶原蛋白具有无毒、止血、易吸收、非抗原、生物相容性和可生物降解等特 性,应用非常广泛,尤其在美容和医学领域,已成功应用于化妆品、矫形、保健、烧伤、创伤、 组织修复、创面止血等方面,故胶原蛋白的生产是近年来生物和化学领域研究的热点。
[0003] 胶原蛋白传统的生产方法是通过酸溶法、碱溶法、中性溶解法或者酶溶法从动物 来源(猪、牛、驴、鱼等)的组织和器官,比如皮肤、软骨、骨骼等提取和纯化,但提取出来的胶 原蛋白水溶性差、纯度低,并且存在着病毒反应和人体排异反应。为了解决这一难题,利用 生物技术手段进行对微生物进行基因重组的改造成为了主流,目前胶原蛋白已成功的在多 种宿主中得到了表达,主要有大肠杆菌、酵母菌等。但是由于细菌表达具有诸多弊端,比如 内毒素、热源等安全问题,蛋白以包涵体的形式存在于细胞内,提取纯化困难,而在毕赤酵 母中具有较高的分泌表达特性,目前在毕赤酵母表达过程中,诱导的模式是添加诱导剂甲 醇,而甲醇对菌体具有一定的毒害作用,其量应该要严格准确的控制,量少诱导强度不够, 蛋白产量低,量多会对菌体产生毒害作用,使一部分菌体细胞自溶死亡,从而给后期提取纯 化带来很大的麻烦,故而蛋白表达量受到了诱导剂甲醇很大的限制。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一种能够克服甲醇对蛋白高效表达的限制,生产成本低,并 适用于工业化大规模生产的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法。
[0005] 本发明所使用的菌种为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168保藏编号: 〇6皿〇:如.7189保藏时间为2013.01.29分类命名:巴斯德毕赤酵母(?丨(^丨3?38如48) SMD1168保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006] 毕赤酵母是甲醇营养型酵母,可利用甲醇作为其唯一碳源,醇氧化酶利用氧分子 将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢,为避免过氧化氢的毒性,甲醛代谢主要在一个特殊的细胞 器一过氧化物酶体里进行,使得有毒的副产物远离细胞其他组分,由于醇氧化酶与氧分子 的结合率低,因而毕赤酵母代偿性的产生大量的酶,而调控产生醇过氧化物酶的启动子也 正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。毕赤酵母经过快速生长阶段之后,菌体已 经得到了大量的积累,满足了进行诱导表达的生物量条件,由于甘油是作为生长阶段的碳 源,而诱导表达阶段所采用的唯一碳源和能源是甲醇,同时也是使菌体表达蛋白的诱导剂, 所以涉及到碳源的代谢转换,故本发明采用分阶段诱导,使毕赤酵母更好的适应诱导剂甲 醇。
[0007]本发明的目的是提供一种能够克服甲醇对蛋白高效表达的限制,生产成本低,并 适用于工业化大规模生产的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法。
[0008]本发明胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法,包括以下步骤:
[0009] (1)菌种的纯化与保藏、活化与扩培;
[00?0] (2)摇瓶、种子罐的种子培养;
[0011] (3)发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段;
[0012]甲醇驯化过程为:
[0013]第一阶段加入甲醇,使发酵罐溶氧下降至16 %-20 %,维持时间3_4h,之后溶氧回 升;第二阶段加入甲醇,使发酵罐内溶氧下降至15%_20%,维持时间2-3h;
[0014]初始诱导阶段过程为:
[0015]调节发酵罐内的温度为28°c,采用间歇式恒速流加甲醇,控制溶氧在18%-22%, 设置搅拌转速为650rpm,流量为1L/(L·min),罐压为0.05MPa并保持不变,待生物量达到 240-260g/L时此阶段结束;
[0016] 混合加大诱导阶段为:
[0017] 调整发酵罐内温度为25°C,将通气流量由1L/(L·min)提高至1.3L/(L·min),罐 压升高至〇.〇7MPa_0.09MPa,加大甲醇的流加速率以维持18%-22%的溶氧,一直维持到发 酵结束,菌体湿重维持恒定或下降幅度超过20g/L,此阶段结束;
[0018] (4)将步骤(3)所得的发酵液后处理后,得到胶原蛋白。
[0019]所述甲醇驯化过程中第一阶段发酵罐内控制甲醇的浓度为0.3%,第二阶段发酵 罐内控制甲醇的浓度为〇. 5 %。
[0020] 所述种子罐的种子培养基和发酵罐内菌体培养基为改良后的FBS培养基,其配方 为:
[0022]所述初始诱导阶段采用间歇式恒速流加甲醇,流加速率是3.55-3.95ml/h/L。
[0023] 所述混合加大诱导阶段甲醇的流加速率为9.0-9.30ml/h/L。
[0024] 所述后处理包括离心去菌体、缓冲液抽提、盐析、离子交换、柱层析精制和冷冻干 燥,细胞经离心后获得上清液,然后加入甲酸缓冲液进行抽提,盐析粗提,用离子交换树脂 吸附以〇. 5mol/LNaCl、20mMTrispH8.0洗脱后,再用金属螯合柱吸附、洗脱,收集蛋白冷冻 干燥,即可获得胶原蛋白样品。
[0025]与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
[0026] (1)本发明采用巴斯德毕赤酵母基因工程菌表达人胶原蛋白,生长繁殖快,醇氧化 酶基因的启动子具有强诱导性和启动性,与动物来源的产品相比无病毒隐患,与原核生物 表达体系相比,其表达载体不是以游离质粒形式存在,而是整合到染色体上,菌株十分稳 定,同时毕赤酵母为分泌表达,易于后期纯化,培养基大部分为无机盐,价格低廉,适合大规 模发酵生产;
[0027] (2)本发明与用单一阶段添加诱导剂进行诱导相比,菌体对碳源甲醇有更好的适 应过程,在此基础上,进入初始诱导阶段,兼顾生长与表达,生物量得到了进一步的积累,最 终进入蛋白的大量表达阶段,即混合加大诱导阶段,循序渐进,逐渐加大诱导强度,在菌体 很好的适应诱导剂的同时,目标蛋白的产量也得到了大量的提高;菌体未出现自溶,发酵液 未大量出现泡沫;与单一用温度诱导的方式相比,保证了目标胶原蛋白的正确折叠,同时提 高动力条件满足了菌体在诱导表达阶段对溶氧的大量需求,加大了诱导的强度,提高了目 标胶原蛋白的表达产量,同时又不会造成菌体中毒现象的发生,最终使发酵单位提高了 18%-20%,诱导剂利用率提高了 7%-15%。
【附图说明】
[0028]图1为本发明不同诱导方式的结果比较图,坐标轴X上1,2,3分别代表单纯用诱导 剂诱导、诱导剂加低温诱导,混合加大诱导;
[0029]图2为不同诱导方式甲醇利用率的比较图,坐标轴X上1,2,3分别代表单纯用诱导 剂诱导、诱导剂加低温诱导,混合加大诱导。
【具体实施方式】
[0030] 以下结合实施例对本发明做进一步详细的描述。
[0031] 实施例1
[0032]本发明胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法,包括以下步骤:
[0033] (1)菌种的纯化与保藏、活化与扩培;
[0034] (2)摇瓶、种子罐的种子培养;
[0035] (3)发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段;
[0036] 发酵罐内菌体培养:
[0037]配FBS培养基,校正pH电极,校正溶氧电极,灭菌,降温到30°C,注意水分蒸发损失。 插入补料瓶:氨水瓶、消泡剂瓶。补料50 %的甘油、甲醇;校正蠕动栗,精确计量进样体积;设 置转速300rpm,空气通气量1.0L/(L·min),温度为30°C,pH为5.0,温度自动控制;与氨水栗 级联控制,并开始校正培养基pH;接种前,每升培养基加入4.35ml无菌PTM1 (微量元素盐); 按照8%的接种量,将菌种从种子罐移入发酵罐,接入前需做镜检。随着菌体对甘油的消耗, 待溶氧下降至18%_22%,提高搅拌转速为300rpm,使溶氧控制在20%-40%,待甘油耗尽, 溶氧回升到100%以后,流加甘油速度11.8ml/h/L,维持溶氧在18%-22%,此时生物量逐渐 积累,待生物量积累到细胞湿重应达到200g/L时,停止流加甘油,保持40min,然后进入甲醇 驯化过程。
[0038]甲醇驯化阶段:
[0039]第一阶段在发酵罐中加入甲醇,使发酵罐内甲醇浓度为0.3%,随后溶氧会急剧下 降,当下降至16%-20%,溶氧又会产生回升,回升至40%-45%,然后维持9min恒定,之后溶 氧又继续下降,下降幅度为8%-12%,然后溶氧急剧的上升,此时说明第一次加入的甲醇已 完全消耗殆尽,此阶段时长为3-4h;
[0040] 第二阶段加入甲醇使发酵罐内甲醇浓度达到0.5%,溶氧立即下降至15%-20%, 维持2h,然后溶氧立马回升,说明此阶段加入的甲醇已完全消耗殆尽,可进入初始诱导阶 段。
[0041] 初始诱导阶段:
[0042]此阶段首先调节发
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