基于dpo引物的实时荧光pcr检测屎肠球菌的dpo引物、方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及菌株检测领域，特别涉及检测样品中屎肠球菌或者含有屎肠球菌DNA 的方法以及用于该方法的引物、含有该引物的组合物和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 屎肠球菌（EnterococcusFaecium)是一种常见的病原菌。目前屎肠球菌的检测 主要依靠传统生理生化和分子生物学方法进行。传统生理生化耗时耗力，不能满足实际检 测的需要。基于特异性引物的PCR的方法具备快速、准确、低成本的优点，目前被广泛用于 转基因、食源性微生物、医学病原菌等方面的检测。目前PCR法已经被应用于屎肠球菌的检 测，但普通PCR需要凝胶电泳判断结果，耗时耗力。另外，而不同实验室之间由于仪器、人 员等差异，可能会无法精确重复出试验的各项条件，导致检测特异性受到影响，可能照成误 判。
[0003]SYBRGreenI是一种小分子DNA染料，游离时不会发射任何荧光信号，但当与双 链DNA特异地结合时，荧光染料掺入DNA双链，发射出强烈的荧光信号，同时PCR产物的特 异性可以用熔解曲线分析进一步确认，利用SYBRGreenI这一特性建立的实时荧光PCR在 植物病原菌检测方面已广泛应用。DPO(Dualprimingoligonucleotide)引物技术的主要 原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5'端序列由18-25个碱基组成并与 靶基因序列配对，3'端序列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的 特异性区域利用寡聚次黄嘌呤（Inosine，I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温 度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5'和3'区域形两个独立功能 的双特异性引物结构，并且研究表明5'和3'引物区域中任何有3个及以上碱基的错配， PCR反应将不能进行。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力、通用性 和实用性强的基于DP0引物的实时荧光PCR用于检测屎肠球菌方法，本发明还提供了用于 该方法的DP0引物和含有该DP0引物的试剂盒。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现： 基于DP0引物的实时荧光PCR检测屎肠球菌的DP0引物， 所述DP0 引物上游引物EF-DP0-F设为SEQIDNO. 1，5'-GGCGGACATGCTAACCATTCAIII IICTGGGAAATC-3'，下游引物EF-DP0-R设为SEQIDΝ0· 2，5'-CCATCAATGGAGAATCTTGATTT GIIIIIGAGGTAATAGCHy，其中I碱基为次黄嘌呤。 一种检测样品中屎肠球菌的方法，该方法包括如下步骤： (1) 待测细菌样品基因组DNA的提取； (2) 实时荧光PCR反应：以含有DNA的样品为模板与DP0引物进行实时荧光PCR反应， 所述DPO引物为SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2 ; (2)判断待检样品。 所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：
所述实时荧光？〇?反应的程序如下：95°(：预变性308、95°(：变性58、50-60°(：退火308、 72°C延伸30s，35个循环。优选的，所述的退火温度为55°C。 一种基于DP0引物或至少包含DP0引物的细菌样品检测试剂盒。
[0006] 本发明的有益效果包括：（1)本发明针对屎肠球菌的SodA基因设计特异性DP0引 物，建立了实时荧光PCR法；（2)本发明将SYBRGreenI实时荧光PCR和DP0引物检测技 术相结合，吸收了DP0引物高特异性且引物之间难以形成二聚体等优点，成功建立了一种 特异性强、灵敏度高的屎肠球菌的检测方法；（3)本发明的DP0引物的特异性在较低退火温 度（50°C)和较高的退火温度下（60°C)下结果一致，这大大增强了本发明的DP0引物和方 法在不同实验室之间的通用性；（4)本发明将DP0引物和SYBRGreenI的实时荧光PCR结 合起来，检测结果易于判断，无需凝胶电泳，这也增强了本方法的实用性。
【附图说明】
[0007] 下面结合附图对本发明作进一步的说明。 图1为特异性图；其中1-10分别为为屎肠球菌（ATCC 35667)、粪肠球菌（ATCC 29212)、溶藻弧菌（ATCC 17749)、副溶血弧菌（ATCC17802)、奇异变形杆菌（ATCC 29245)、 大肠杆菌（ATCC 11229)、单增李斯特菌（ATCC 7644)、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213)、伤寒 沙门氏菌（ATCC 14028)、枯草芽孢杆菌（ATCC 21332)。 图 2 为灵敏度图；1-6 分别为 100ng/yL、10ng/yL、lng/yL、0.lng/yL、0. 01ng/yL、 0.OOlng/μL〇
【具体实施方式】 除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
[0009] 本发明通过检测屎肠球菌的SodA基因来检测样品中的屎肠球菌。由此，运用本方 法可以快速的检测出样品中的屎肠球菌。
[0010] 本发明检测屎肠球菌的SodA基因是通过实时荧光定量PCR来实现的。
[0011] 为了实现上述目的，本发明针对屎肠球菌的SodA基因设计了特异性DP0引物。
[0012] 在一个具体实施例中，所用的特异性DP0引物包含SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2 所示的核苷酸序列。
[0013] 本发明DP0引物的特异性在较低退火温度（50°C)和较高的退火温度下（60°C) 下的结果一致，这大大增强了本方法在不同实验室之间的通用性。
[0014] 在一个具体方面，本发明涉及一种检测样品中屎肠球菌的方法，该方法包括： (1) 实时荧光PCR反应 以含有DNA的样品为模板与DP0引物进行实时荧光PCR反应，所述DP0引物为SEQID N0:1和SEQIDN0:2 ; (2) 判断待检样品 在步骤（1)之前还可以包括DNA的提取步骤。
[0015] 所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：
[0016] 所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：所述实时荧光PCR反应的程序如下： 95°C预变性 30s;95°C变性 5s、50-60°C退火 30s、72°C延伸 30s，35 个循环。
[0017] 下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅 是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领 域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂 商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0018] 实施例1、本实施例提供了样品中屎肠球菌的检测方法，包括如下步骤： 步骤一：基因组DNA的提取 采用细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司，货号为DP302) 对样品提取DNA，参照说明书的要求操作。
[0019] 步骤二：实时荧光PCR反应 实时荧光PCR反应体系如下：