兔中型艾美耳球虫荧光定量pcr检测引物和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测技术领域，更具体地，涉及兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR检测 引物和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 兔球虫病是一类由兔艾美耳球虫寄生于家兔肝胆管和肠道上皮细胞内所引起的 一种最常见的原虫性疾病。该病危害严重，流行广泛，感染率高，对养兔业的危害极大，每 年造成巨大的经济损失，呈世界分布，据报道1~3月龄的幼兔感染率可达100%，患病后 幼兔的死亡率高达70%左右，在我国很多地区也均有感染报道。该病病原种类多达11个 种，分别是斯氏艾美耳球虫（Eimeria stiedai)、穿孔艾美耳球虫（Eimeria perforans)、 大型艾美耳球虫（Eimeria magna)、梨型艾美耳球虫（Eimeria piriformis)、肠艾美耳 球虫（Eimeria intestinalis)、维氏艾美耳球虫（Eimeria vejdovskyi)、中型艾美耳球 虫（Eimeria media)、无残艾美耳球虫（Eimeria irresidua)、小型艾美耳球虫（Eimeria exigua)、黄艾美耳球虫（Eimeria flsvescens)和盲肠艾美耳球虫（Eimeria coecicola)。 其中流行病学调查显示中型艾美耳球虫流行广泛。
[0003] 目前常用的诊断方法是饱和盐水漂浮法，浮卵后通过显微镜检测粪便中的卵囊。 兔球虫呈混合感染，各个虫种卵囊之间的形态特征不是十分明显，增加了临床操作人员鉴 别诊断的难度。因此建立一种准确、简便、快速的兔球虫鉴别诊断方法意义重大。
[0004] 实时定量PCR(Real-timePCR)技术在PCR反应体系中加入荧光基团，以荧光信号 的强度实时监测整个PCR反应的进程，最后达到对未知模板进行定量分析的方法。反应体 系中加入荧光基团后，随着反应的每一步扩增荧光信号逐渐增强，这些荧光信号可以被仪 器设备实时地采集、分析，同时绘制出一条循环反应数与荧光信号强度的标准曲线。PCR反 应初期产生的荧光信号弱，当DNA扩增进入指数期，产生的荧光信号越来越强，达到能被检 测到的水平，因此选取DNA指数扩增期的某一点来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初 的含量，达到对模板的定量检测。常用的有SYBRGreenI染料法和TaqMan探针法，SYBR GreenI法成本低、操作简便，虽然其特异性不如TaqMan探针法，但使用特异性高的引物， 优化反应体系与条件，消除非特异性扩增和二聚体的生成，也能达到很高的特异性。SYBR GreenI能结合到dsDNA小沟部位，是一种具有绿色激发波长的染料，它只有与dsDNA结合 才会发出荧光，在变性时，DNA双链分开，不产生荧光，在复性和延伸时，形成dsDNA，SYBR GreenI发出荧光。与普通PCR相比，荧光定量PCR具有灵敏、精确、简单、快速等优点，在 PCR的扩增及分析过程均在同一封闭系统下完成，只需一次打开PCR反应管，避免交叉污染 导致假阳性的产生，被广泛的应用于各种临床病原的检测。
[0005]ITS序列是位于核糖体DNA序列中的一段内转录间隔区序列，ITS序列不同于其两 端的大小亚基基因，ITS区不加入成熟的核糖体，功能上不受限制，受到的选择压力较小，导 致其在核苷酸长度和序列上出现了很大的变异。特别适合作为种间分类鉴定的分子标记， 已广泛应用于寄生虫病原的分类鉴定研究上。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中兔球虫病检测所存在的缺陷，提供 一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR检测引物对。
[0007] 本发明的第二个目的是提供含有所述检测引物的检测试剂盒。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
[0009] 一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR检测引物对，所述引物对为Me-F和 Me-R，其序列如SEQIDN0 :1~2所示。
[0010] 本研究首先对兔中型艾美耳球虫广西玉林分离株兔球虫的核糖体ITS序列进行 PCR扩增、测序分析，与GenBank中公布的序列进行序列分析，发现ITS序列表现出种内相对 保守而种间差异较大的特征。适合作为种间分子鉴定的分子标记序列。发明人通过设计多 对引物，最终筛选获得一对能特异性检测兔中型艾美耳球虫病的引物。
[0011] 本发明还提供检测兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒含有 所述的检测引物对和荧光定量检测试剂。
[0012] 优选地，所述试剂盒中Me-F和Me-R的浓度分别为25pmol/uL。
[0013] 优选地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。
[0014] 优选地，所述荧光定量检测试剂为SYBRGreenPrimixExTaqII，所述DNA提取 试剂为QIAampDNAStoolMiniKit。
[0015]更优选地，所述QIAampDNAStoolMiniKit为 100 个反应的 140mL的ASL Buffer、l. 5mL的proteinaseK、20mL的BufferAL、50mL的BufferAWl、50mL的Buffer AW2、10mL的BufferAE、20mL的96%~100% 酒精。
[0016] 优选地，所述试剂盒的焚光定量PCR反应体系为：SYBRGreenPrimixExTaqII 10μL，Me-F和Me-R各 0· 25μL，模板DNA2μL，ddH20 7. 5μL，共 20μL。
[0017] 优选地，所述试剂盒的荧光定量PCR反应条件为：95°C预变性30s;95°C变性5s， 59°C退火30s，72°C延伸30s共运行40个循环。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0019] 本发明通过设计筛选获得一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR检测引 物对，所述引物对为Me-F和Me-R，其序列如SEQIDN0 :1~2所示，基于所述引物优化反应 体系和反应条件，研制出一种基于荧光染料法的定量检测兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR 试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观。该方法可实现对 兔球虫病的流行病学调查及临床诊断，为兔球虫的诊断和防治技术，临床快速而准确的检 测兔球虫的感染情况提供技术支持。
【附图说明】
[0020] 图1为兔中型艾美耳球虫的荧光定量PCR特异性扩增图及溶解曲线；其中1~4 分别为中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和黄艾美耳球虫。
[0021] 图2为兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR扩增曲线及标准曲线；1~5分别为兔中 型艾美耳球虫DNA原液按10~105倍稀释得到的五个稀释度DNA，其中，图2A是兔中型艾 美耳球虫荧光定量PCR扩增曲线，图2B是兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR标准曲线。
[0022] 图3为兔中型艾美耳球虫荧光定量检测方法的敏感性试验扩增图；1~6分别为 兔中型艾美耳球虫DNA原液按10~106倍稀释得到的6个稀释度DNA。
【具体实施方式】
[0023] 下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对 本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修 改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术 人员所熟知的常规方法和技术，所使用的试剂或材料均为通过商业途径得到。
[0024] 实施例1引物设计和筛选
[0025] 首先对兔中型艾美耳球虫广西玉林分离株兔球虫的核糖体ITS序列进行PCR扩 增、测序分析，与GenBank中公布的序列进行序列分析，发现ITS序列表现出种内相对保守 而种间差异较大的特征，适合作为种间分子鉴定的分子标记序列。在种内保守的区域设计 特异性引物，并参考国外已报到的特异性引物，通过实验验证筛选出最为合适的引物，用于 定量实验。
[0026] 表1兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR引物设计
[0027]
[0028] 由表1所设计的序列进行荧光定量PCR，结果表明：只有引物组1能够特异性的扩 增。
[0029] 为了验证引物的特异性，将4种艾美耳球虫（中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、 肠艾美耳球虫和黄艾美耳球虫）分别作为模板做荧光定量PCR实验，检测中型艾美耳球虫 引物特异性，同时设无模板阴性对照。反应体系和反应条件同上，扩增完做熔解曲线，结果 显示本发明所述引物的荧光定量检测方法特异性强，见图1。
[0030] 实施例2试剂盒的制备和使用方法
[0031] 试剂盒内含粪便DNA提取试剂（QIAampDNAStoolMiniKit)，其中含100个反应 的 140mL的ASLBuffer、1.5mL的proteinaseK、250mL的BufferAL、50mL的BufferAW1、 50mL的BufferAW2、10mL的BufferAE、2