致肝脓肿肺炎克雷伯菌特异性基因序列lak及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学疾病诊断和治疗药物选择领域，具体涉及致肝脓肿肺炎克雷伯菌 基因特异性序列及lak其应用。
【背景技术】
[0002] 肺炎克雷伯菌（K.pneumoniaesubsp.pneumonia)，属于肠杆菌科细菌，革兰染 色阴性，有较厚的荚膜，多数有菌毛，无芽孢和鞭毛，寄生于人体皮肤、鼻咽部和肠道等 处，可引起严重的肺炎、尿路感染和血流感染等，是临床上常见的条件致病菌（LiB，Zhao Y，LiuC，ChenZ,ZhouD.MolecularpathogenesisofKlebsiellapneumoniae.Future Microbiol，2014 ;9 (9):1071-81)。
[0003] 肝脓肿（LiverAbSCeSS，LA)是发生于肝脏的一种继发性感染性疾病，可以由细 菌、真菌、寄生虫等引起，感染病变中心液化坏死、组织溶解、肉芽组织覆盖并形成脓腔， 是常见的消化系统严重疾病。20世纪70年代以前，细菌性肝脓肿主要由以大肠埃希菌 为主，当时非手术治疗肝脓肿的死亡率高达83%，手术治疗的死亡率高达28%，促成高死 亡率的主要原因是途断和治疗的不及时（VallesJ，C.Leon，Alvarez-Lerma.Nosocomial bacteremiaincriticallyillpatients:amulti-centerstudyevaluating epidemiologyandprognosis.ClinInfectDis，1997,24:387-395)。1986 年，台湾Liu等 人首次报道了由肺炎克雷伯菌导致的肝脓肿病例7例（LiuY，ChengD，LinC.Klebsiella pneumoniaeliverabscessassociatedwithsepticendophthalmitis.ArchInternMed 1986 ;146:1913 - 16)。随后肺炎克雷伯菌肝脓肿在东亚地区开始流行，包括：中国、新加 坡、香港、韩国和越南等。1999年，美国出现肺炎克雷伯菌肝脓肿病例并开始流行（Saccente M.Klebsiellapneumoniaeliverabscess,endophthalmitis，andmeningitisinaman withnewlyrecognizeddiabetesmellitus.ClinInfectDis. 1999 ;29 (6):1570 -L); 2012年欧洲出现肺炎克雷伯菌肝脓肿病例（MooreR，O'SheaD，GeogheganT，Mallon PW，SheehanG.Community-acquiredKlebsiellapneumoniaeliverabscess:an emerginginfectioninIrelandandEurope.Infection2013 ；41 (3) :681-6.);至今， 肺炎克雷伯菌肝脓肿遍及全球。随着科技的发展，超声或CT定位下经皮穿刺引流联合高 效广谱抗生素是治疗肺炎克雷伯菌肝脓肿的有效方式，但肺炎克雷伯菌肝脓肿病死率仍 ?4-16%(WangJ，LiuY，LeeS，YenM，ChenY，WangJ,ffannS，LinH.Primaryliver abscessduetoKlebsiellapneumoniaeinTaiwan.ClinInfectDis. 1998 ；26:1434 - 8)。其主要原因为肺炎克雷伯菌肝脓肿不能及时诊断，从而耽误有效治疗。
[0004] 临床上，肺炎克雷伯菌肝脓肿常伴发其他部位的感染，常见的是血流感染、眼炎 和脑膜炎。除了其伴发感染的典型症状外，肺炎克雷伯菌肝脓肿本身的临床表现没有其 特征性，主要表现为发热、寒战和腹痛（ChanK，YuW，TsaiC，ChengK，HouC，LeeM，Tan C.PyogenicliverabscesscausedbyKlebsiellapneumoniae:analysisofthe clinicalcharacteristicsandoutcomesof84patients.ChinMedJ(Engl)2007 ； 120:136 - 39)。其实验室检查指标的变化（如白细胞计数、中性粒细胞比例和肝功能指标 等）也并非肺炎克雷伯菌肝脓肿所特异（LeeS,ChenY,TsaiH，WannS,LinH,HuangC,Liu Y.Predictorsofsepticmetastaticinfectionandmortalityamongpatientswith Klebsiellapneumonialiverabscess.ClinInfectDis2008;47:642 - 50)。因此，临床 上往往容易遗漏肺炎克雷伯菌肝脓肿的相关检查。肺炎克雷伯菌肝脓肿的诊断存在不少的 困难。临床上，肺炎克雷伯菌肝脓肿的诊断金标准是超声或CT引导下经皮肝穿刺抽吸脓 液，脓液中分离培养到肺炎克雷伯菌。但是，脓腔中的细菌往往因为患者前期抗生素的使用 以及大量白细胞的吞噬和裂解，多为死菌，培养阳性率较低。血液中分离培养到肺炎克雷伯 菌，结合肝脏脓腔占位的影像学结果，也能作出肺炎克雷伯菌肝脓肿的推测性诊断，但如果 是早期的肝脓肿，脓腔隐匿，影像学上表现不明显，如不加以注意，就容易漏诊。加之，血培 养耗时长，从血培养阳性报警，到最后鉴定出菌种，还需要24-48小时，耽误肺炎克雷伯菌 肝脓肿的诊断。
[0005] 本发明目的在于找到致肝脓肿肺炎克雷伯菌的特异性因子，从而通过简单、快速 的PCR方法筛查这些因子在血培养阳性患者血液中的存在情况，如特异性因子PCR结果阳 性，说明该患者血中很可能存在致肝脓肿肺炎克雷伯菌，提示临床医生该患者患肺炎克雷 伯菌肝脓肿概率很高，从而指导临床医生及时开具肺炎克雷伯菌肝脓肿相关的检查，提高 肺炎克雷伯菌肝脓肿的诊断速度，及时治疗，为改善患者预后提供基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供了致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列lak，所述的基 因特异性序列为SEQIDN0. 3所示。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供了致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列lak的 引物：
[0008] lak_F：TATCCGCTCAGACAACGACAT
[0009]lak_R：CCGATAATCAGTGCCAGAAAG
[0010] 本发明还有一个目的在于提供了致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列lak或 基于lak设计的引物在制备致肝脓肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括用于制备肺 炎克雷伯菌肝脓肿早期诊断试剂盒中的应用。
[0011] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
[0012] 致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列lak，所述的基因特异性序列为SEQID NO. 3所示。
[0013] 致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列lak的引物，基于lak序列设计的引物 均为本发明的保护范围，优选的，1ak的引物为：1ak_F:TATCCGCTCAGACAACGACAT; 1ak_R: CCGATAATCAGTGCCAGAAAG〇
[0014] 致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列lak或基于lak设计的引物在制备致肝脓 肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括以lak序列为有效标记物在制备致肝脓肿肺炎 克雷伯菌检测试剂盒中的应用，或者以基于lak序列设计的引物为有效组分在制备致肝脓 肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，或者序列lak或基于lak设计的引物在制备肺炎克 雷伯菌肝脓肿诊断试剂盒中的应用，该试剂盒还可用于肺炎克雷伯菌肝脓肿的早期诊断。
[0015] -种致肝脓肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒，包括：
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0021]目前对致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子特征的研究主要局限于筛查普遍报道过的微 生物毒力基因，且特异性不好。本发明通过2株分离自中国大陆的致肝脓肿肺炎克雷伯菌， 对其基因组进行测序，综合了第二代测序技术（Next-GenerationSequencing，NGS)，比较 基因组学（ComparativeGenomics)及生物信息学（Bioinformatics)方法，并采用科学的 统计学方法，更全面、更系统地寻找分析致肝脓肿肺炎克雷伯菌的特异性基因。
[0022] 目前尚无很好的用于肺炎克雷伯菌肝脓肿诊断的分子标志物，而本发明获得了致 肝脓肿肺炎克雷伯菌三段特异性序列，该序列具有很高的特异性，可以用于肺炎克雷伯菌 肝脓肿的诊断，具有商业化开发价值。
[0023] 申请人从细菌全基因组组学角度出发，从临床分离到致肝脓肿肺炎克雷伯菌和非 肝脓肿患者血液中分离的肺炎克雷伯菌，送全基因组测序，测序结果与网上公布的致肝脓 肿肺炎克雷伯菌和非致肝脓肿肺炎克雷伯菌全基因组比对分析，结果发现几个与致肝脓高 度相关的肺炎克雷伯菌基因，分别为sdm、lak和asnC。申请人进一步用sdm、lak、asnC的特 异性引物分别在临床分离的致肝脓肿和非致肝脓肿肺炎克雷伯菌中做了测试，结果显示： 在致肝脓肿肺炎克雷伯菌中，sdm的阳性率达100%，lak和asnC的阳性率为82%以上；在 非致肝脓肿肺炎克雷伯菌中，3个基因的检出率全为0%，结果说明这3个基因都具有很高 的特异性，可以作为诊断肺炎克雷伯菌肝脓肿的分子标志物。此发现为临床医生和实验室 人员诊断肺炎克雷伯菌肝脓肿提供依据，特别是在血液等其他体液来源标本的培养结果正 式报告前，利用患者血液标本或肝脏脓腔脓液，采用快速的PCR方法检测致肝脓肿肺炎克 雷伯菌特异性基因sdm、lak和asnC的有无，结合患者临床表现和