Pml基因和rara基因检测探针及其制备方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术，特别是涉及PML基因和RARA基因检测探针及其制备方法和 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 急性早幼粒细胞白血病（Acutepromyelocyteleukemia，APL)是一类非淋巴细胞 白血病，临床表现凶险，起病及治疗过程中容易发现出血和栓塞而引起死亡，但对诱导分化 治疗反应表现好。98%以上APL有着特异的基因表型，表现为t(15 ;17) (q22 ;q21)相互易 位，易位形成的PML/RARa融合基因表达蛋白显性负抑制作用抑制早幼粒细胞分化成熟， 使细胞阻断在早幼粒阶段，抑制其分化。近二十年来，全反式维甲酸（ATRA)及砷剂的临床 应用使APL成为可以治愈的白血病之一。
[0003] 检测PML/RARα融合基因是诊断APL最特异、敏感的方法之一，也是APL治疗方案 选择、疗效分析、预后分析和复发预测最可靠的指标。通过细胞遗传学方法（染色体和荧光 原位杂交法）检测t(15 ;17)阳性即可诊断APL。
[0004]目前常用的检测方法中，染色体分析需要进行外周血培养，耗时长，过程复杂，检 测结果判断对经验要求高；分子生物学（如PCR方法）直接进行RNA融合基因检测，检测灵 敏度高，但只能检测已知融合类型；而FISH方法操作简单，可以检测90%的典型易位和约 5%的不典型易位，报告速度快，有利于快速靶向治疗。
[0005]焚光原位杂交（FluorescenceinsituhybridizationFISH)是 20 世纪 80 年代 末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前 这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分 析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知 的标记核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形 成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因 而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标 记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特 点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
[0006] 杂交所用的探针大致可以分类三类：1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、 卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信 号强，易于检测；2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一 区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获 得；3)特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
[0007] 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记 DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和 素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp左右的片段。而直 接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探 针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，临床使用方便。
[0008] 而目前对于PML/RARA基因FISH检测，还缺少特异性高的检测试剂盒。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的之一是提供一种PML基因和RARA基因检测探针及其制备方法，所制 备的探针可用于检测PML基因和RARA基因状态，即检测PML基因和RARA基因检测，实现细 胞和染色体中直接观察信号，具有很好的特异性。
[0010] 实现上述目的的技术方案如下。
[0011] 一种PML基因和RARA基因检测探针的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (4)选取针对PML基因的BAC克隆为RP11-832J18、CTD-2529B11、RP11-756N20和 RP11-1031J4中至少一种，和选取针对RARA基因的BAC克隆为CTD-2360L10、RP11-737D6、 CTD-3087022、RP11-48010和CTD-2134K5中至少一种；
[0013] (5)对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；
[0014] (6)用荧光素标记质粒DNA，针对同一种基因的质粒DNA所标记的荧光素相同，针 对PML基因和针对RARA基因的检测探针标记的荧光素的颜色不相同，即得。
[0015] 在其中一个实施例中，所述PML探针的BAC克隆为RP11-832J18、CTD-2529B11、 RP11-756N20 和RP11-1031J4。
[0016] 在其中一个实施例中，所述RARA探针的BAC克隆为CTD-2360L10、RP11-737D6、 CTD-3087022、RP11-48010和CTD-2134K5。
[0017] 在其中一个实施例中，标记荧光素选择本领域已知的荧光染料，优选地，荧光素为 AlexafltlO；r?488、FITC、AlexaFlllOT?555>Rhodamine、TexasRed、pacificHue?、 DEAC〇
[0018] 在其中一个实施例中，基因探针的标记可以采用现有技术中的方法将相应荧光素 标记至双链核酸上，所述方法包括但不限于：随机引物法、切口平移等，标记基因探针可以 使用市售的缺口平移标记试剂盒和随机引物标记试剂盒，优选abbott和Roche公司的Nick Translation Kit。本发明步骤（3)优选采用随机引物法、切口平移法对质粒DNA进行焚光 素丰不记。
[0019] 在其中一个实施例中，所述标记的温度为15°C-18°C，标记的时间为8-12小时。
[0020] 本发明的另一目的是提供一种PML基因和RARA基因检测试剂盒。
[0021] 实现该目的技术方案如下。
[0022] 一种PML基因和RARA基因检测试剂盒，包括有上述PML基因和RARA基因检测探 针。
[0023] 在其中一个实施例中，还包括有用于封闭重复序列的COTHumanDNA，和DAPI复染 剂。
[0024] 本发明具有以下有益效果：
[0025](1)本发明通过筛选到最优的PML/RARA融合基因检测探针及其组合，采用 FISH(Fluorescence In-Situ Hybridization)方法对PML/RARA融合基因检测，信号计数行 准确、快速，且结果的重复性好；补充了临床中PML/RARA融合检测依赖进口的不足，有利于 筛选更多受益于靶向药物的患者，提高急性早幼粒细胞白血病患者生存率和总生存期。
[0026] (2)本发明优选克隆检测特异性好，灵敏度高。通过对大片段重排的直观检测，不 易遗漏复杂变异类型，对未知融合类型也有很好的鉴别性。
[0027] (3)通过本发明所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARA融合试剂盒，从基因 水平了解PML/RARA融合状态改变，多种信号类型表现出实体组织的肿瘤细胞遗传多样性， 可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的应用，有助综合评价各分子标志物，辅助临床 靶向治疗用药及治疗方案选择。
【附图说明】
[0028] 图1A为是实施例1中PML基因检测探针序列的不意图。
[0029] 图1B为是实施例1中RARA基因检测探针序列的不意图。
[0030] 图2为实施例1中人外周血培养细胞片PML基因和RARA基因检测探针FISH检测 结果图。
[0031] 图3为实施例4中临床骨髓样本FISH检测结果图，其中，检测信号类型为2R2G， PML/RARA融合基因检测阴性。
[0032] 图4为实施例4中临床骨髓样本FISH检测结果图，其中，检测信号类型为1R1G2F， PML/RARA融合基因检测阳性。
【具体实施方式】
[0033] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不 同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地