N末端截短的糖基转移酶的制作方法
【专利说明】N末端截短的糖基转移酶
[0001] 本公开涉及具有N末端截短缺失的糖基转移酶变体。与此前的发现相反，某些包 含保守氨基酸基序（"QVWxKDS"，SEQ ID N0:2)的截短部分被发现与糖基转移酶酶活性并 存，特别是在人唾液酸转移酶（hST6Gal-I)中。因此，公开了哺乳动物糖基转移酶变体、编 码其的核酸、重组产生所述哺乳动物糖基转移酶变体的方法和手段及其用途，特别是用于 唾液酸化作为糖蛋白（如免疫球蛋白）的一部分的聚糖部分的末端受体基团。
[0002] 背景 转移酶(EC2)催化官能团从一个物质转移到另一个物质。糖基转移酶，一个酶超家族， 其涉及合成糖蛋白、糖脂及葡糖氨基葡聚糖的碳水化合物部分。特定的糖基转移酶通过将 经活化的糖供体的单糖部分依次转移到受体分子而合成低聚糖。因此，"糖基转移酶"催化 糖部分从其核苷酸供体转移到多肽、脂质、糖蛋白或糖脂的受体部分。这个过程也被称为 "糖基化"。作为例如糖蛋白的结构部分的碳水化合物部分也被称为"聚糖"。聚糖是所有已 知的翻译后蛋白质修饰中最普遍的。聚糖涉及广泛而多样的生物识别过程，如粘附、免疫应 答、神经细胞迀移和轴突延伸。作为糖蛋白的结构部分，聚糖还在蛋白质折叠以及维持蛋白 质稳定性与生物活性中起作用。
[0003] 在糖基转移酶催化中，单糖单元葡萄糖（Glc)、半乳糖（Gal)、N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc)、葡糖醛酸（GlcUA)、半乳糖醛酸（GalUA)和木糖作 为尿苷二磷酸（UDP) - a -D衍生物被活化；阿拉伯糖作为UDP- β -L衍生物被活化；甘露糖 (Man)和岩藻糖分别作为⑶Ρ- a -D和⑶Ρ- β -L衍生物被活化；而唾液酸（=Neu5Ac ;= SA) 作为β -D-Neu5Ac的CMP衍生物被活化。
[0004] 许多不同的糖基转移酶参与了聚糖的合成。糖蛋白的碳水化合物部分的结构多样 性尤其大并且由复杂的生物合成途径所确定。在真核生物中，糖蛋白聚糖部分的生物合成 在内质网（"ER"）腔内和高尔基体内进行。糖蛋白的单个(支链或直链的）碳水化合物链通 常为N-或0-连接的聚糖。在翻译后加工的过程中，碳水化合物通常经由天冬酰胺("N-连 接的糖基化")或经由丝氨酸或苏氨酸("〇-连接的糖基化")被连接至多肽。聚糖的合成，无 论N-或0-连接的（="N-/0-连接的")，均受到若干不同的膜锚定型糖基转移酶的活性的 影响。糖蛋白可包含一个或多个聚糖连接的氨基酸（="糖基化位点")。具体的聚糖结构可 以是直链或支链的。支化是碳水化合物值得注意的特征，这与DNA、RNA和多肽典型的直链 性质相反。组合其基础结构单元的大的不均一性，单糖、聚糖结构呈现高多样性。此外，在 具体的糖蛋白种类的成员中，连接到特定糖基化位点的聚糖结构可能变化，因而导致各自 糖蛋白种类的微不均一性，即在种内共享多肽部分的相同氨基酸序列。
[0005] 唾液酸转移酶（="ST"）是一种糖基转移酶，其催化唾液酸（=5-N_乙酰神经氨酸 =Neu5Ac = NANA)残基从供体化合物转移到（i)糖脂或神经节苷脂的末端单糖受体基团， 或（ii)糖蛋白的N-/0-连接的聚糖的末端单糖受体基团。对于包括人ST种类的哺乳动 物唾液酸转移酶而言，存在共同的供体化合物，即胞苷-5' - 一磷酸-N-乙酰神经氨酸（= CMP-Neu5Ac = CMP-ΝΑΝΑ)。唾液酸残基的转移也被称为"唾液酸化（sialylating)"和"唾 液酸化作用（sialylation)"。
[0006] 在唾液酸化的糖蛋白的聚糖结构中，（一个或多个）唾液酸（sialyl)部分通常位 于该低聚糖的末端位置。由于该末端，即暴露的位置，唾液酸可以参与许多不同的生物识别 现象并作用于各种各样的生物相互作用中。在糖蛋白中，可存在多于一个唾液酸化位点，即 能够充当唾液酸转移酶底物并作为适用于唾液酸残基转移的受体基团的位点。原则上，此 类多于一个位点可以是锚定在糖蛋白的不同糖基化位点上的多个直链聚糖部分的末端。另 外，支链聚糖可具有多个可发生唾液酸化作用的位点。
[0007] 根据现有知识，末端唾液酸残基可见于（i) α 2 - 3 (α 2, 3)连接至半乳糖基-R， (ii) α2 -6 (α2,6)连接至半乳糖基_R，（iii) α2 -6 (α2,6)连接至Ν-乙酰基半乳 糖胺_R，（iv) α2 -6 (α2,6)连接至Ν-乙酰基葡糖胺-R，以及（ν) α2 -8/9 (α2,8/9) 连接至唾液酸基-R，其中-R代表该受体底物部分的其余部分。因此，通常根据其各自的 单糖受体底物以及根据其催化的糖苷键的3、6或8/9位置，对在唾液酸缀合物（="唾液酸 化作用"）的生物合成中有活性的唾液酸转移酶进行命名和分类。因此，在本领域已知的文 献，例如，Patel RY 等人，Glycobiology 16 (2006) 108-116 中，根据形成糖苷键时 Neu5Ac 残基转移到的受体糖残基的羟基位置，提及了真核生物唾液酸转移酶如（i) ST3Gal、（ii) ST6Gal、（iii) ST6GalNAc或（v) ST8Sia。还可以更通用的方式提及唾液酸转移酶，例如， ST3、ST6、ST8 ;因此，"ST6"具体涵盖催化α 2, 6唾液酸化作用的唾液酸转移酶。
[0008] 二糖部分β -D-半乳糖基-1，4-Ν-乙酰基-β -D-葡糖胺（=Gal β 1，4GlcNAc)是 糖蛋白的N-连接的聚糖天线（antennae)的常见末端残基，但也可以存在于0-连接的聚糖 中以及糖脂中。酶β -半乳糖苷-α 2, 6-唾液酸转移酶（="ST6Gal"）能够催化聚糖的或 聚糖支链（="天线")的末端Gal β 1，4GlcNAc的α 2, 6-唾液酸化作用。对于其一般方面而 言，在文件 DallOlio F. Glycoconjugate Journal 17 (2000) 669-676 中提及。在人和其 它哺乳动物中，存在若干种类的ST6Gal。本公开具体涉及人β -半乳糖苷-α -2, 6-唾液酸 转移酶I (= hST6Gal-I ;EC 2. 4. 99. 1，根据IUBMB酶命名法)，但不限于此。
[0009] 唾液酸转移酶的ST6组包括2个亚组：ST6Gal和ST6GalNAc。ST6Gal酶的活 性催化Neu5Ac残基至游离半乳糖残基的C6羟基的转移，该游离半乳糖残基是聚糖或 聚糖天线中的末端Gal β 1，4GlcNAc的一部分，从而在该聚糖中形成被α 2 - 6连接至 Gal β 1，4GlcNAc部分的半乳糖残基的末端唾液酸残基。所得的聚糖中新形成的末端部分是 Neu5Ac a 2, 6Galβ 1, 4GlcNAc〇
[0010] 人β -半乳糖苷-α -2, 6-唾液酸转移酶I (hST6Gal_I)的野生型多肽，于提交本 文件时作为"UniProtKB/Swiss-Prot: P15907. 1 "在可公共访问的NCBI数据库（http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/115445)中被公开。包括编码序列在内的另外的信息 作为在数据库条目"Gene ID:6480"下编译的超链接（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ gene/6480)提供。
[0011] 哺乳动物的唾液酸转移酶与其它哺乳动物的高尔基体内固有的糖基转移酶(所谓 "II型结构"）共享（i)短的细胞质N-末端尾区、（ii)跨膜片断随后为（iii)长度可变的茎 区以及（iv)面向高尔基体腔内的C末端催化域（Donadio S.等人，于Biochimie 85 (2003) 311-321)。哺乳动物的唾液酸转移酶看似在其催化域展示显著的序列同源性。然而，即便 在一般而言大量的真核生物糖基转移酶（即包括唾液酸转移酶和其它糖基转移酶在内的一 组酶）中，也在氨基酸序列水平上观察到了保守基序，即SEQ ID N0:2的QVWxKDS共有基 序。如SEQ ID N0:1 (野生型序列）所示的人ST6Gal-I ("hST6Gal-I"）也包含此基序，显 著地在hST6Gal-I野生型多肽的氨基酸序列的94-100位置，所述hST6Gal-I野生型多肽例 如于提交本文件时作为"1]11丨?1〇丨1?/5￥丨88^^〇丨:？15907.1"在可公共访问的从^1数据库 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/115445)中被公开。
[0012] 根据Donadio S.等人的出版物（同上)，QVWxKDS共有基序的氨基酸序列对于 hST6Gal-I的催化域获得生物活性构象而言是必不可少的。Donadio S.等人在CH0细胞中 表达了 hST6Gal-I的若干种N末端截短的变体并且发现包含前35、48、60和89个氨基酸的 N末端缺失产生尽管如此但仍在将唾液酸转移到外源性受体中有活性的突变酶。但是发现 具有前100个氨基酸的N末端缺失的hST6Gal-I突变体在此方面是没有活性的。值得注意 的是，hST6Gal_I的这种" Δ 1〇〇"缺失突变体缺少高度保守的QVWxKDS基序。因此，该基序 的存在被Donadio S.等人（同上）总结为对促进唾液酸转移酶的活性至关重要。
[0013] 令人惊奇地并与Donadio S.等人（同上)的发现和教导相抵触，本公开的作者发现 在糖基转移酶多肽的氨基酸序列中缺失包含整个保守QVWxKDS基序的序列部分实际上可 以与糖基转移酶活性，特别是唾液酸转移酶活性并存。
[0014] 概述 在第一个方面，报道了哺乳动物糖基转移酶变体，其中该变体的多肽包含野生型哺乳 动物糖基转移酶的N末端截短的氨基酸序列，该截短部分包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列 基序，并且其中该变体展现出糖基转移酶活性。在第二个方面，报道了编码如本文中所公开 的哺乳动物糖基转移酶变体的多肽的核苷酸序列。在第三个方面，报道了包含靶基因的表 达载体，所述靶基因与在用所述表达载体转化的宿主生物中促进该靶基因表达的序列可操 作地连接，其中该靶基因包含如本文中所公开的核苷酸序列。在第四个方面，报道了经转化 的宿主生物，其中该宿主生物用如本文中所公开的表达载体转化。在第五个方面，报道了重 组产生哺乳动物糖基转移酶变体的方法，该方法包括在经转化的宿主生物中表达编码如本 文中所公开的哺乳动物糖基转移酶变体的核苷酸序列的步骤，其中形成多肽，从而产生该 哺乳动物糖基转移酶变体。在第六个方面，报道了通过如本文中所公开的方法而获得的糖 基转移酶。在第七个方面，报道了如本文中所公开的哺乳动物糖基转移酶变体在将5-N-乙 酰神经氨酸残基从供体化合物胞苷-5' - 一磷酸-N-乙酰神经氨酸或从其功能等同物转移 至受体的用途，该受体为单克隆抗体的聚糖部分中的末端β -D-半乳糖基-1，4-N-乙酰 基-β -D-匍糖胺。
【附图说明】
[0015] 图1 :野生型hST6Gal_I多肽及其Ν末端部分(于Δ27、Δ48、Δ62、Δ89和Δ108 变体中截短）的氨基酸序列的图示。截短部分中缺失的位置用"X"表示。
[0016] 图2 :在巴斯德毕赤酵母中表达并从其分泌的hST6Gal_I变体的电泳和染色后的 SDS凝胶。泳道1和9含有大小标准品，在左侧表明了根据该标准品的以kDa表示的分子量。 泳道 2: Δ62;泳道 3: Δ48;泳道 4: Δ27("克隆 103"）；泳道 5: Δ27("克隆 154"）； 泳道 6 : Δ 62 ("克隆 356"）；泳道 7 : Δ 48 ("克隆 9"）；泳道 8 : Δ 89 ("克隆 187")。
[0017] 图3 :在ΗΕΚ细胞中瞬时表达并从其分泌的Δ 108 hST6Gal_I变体的电泳和染色 后的SDS凝胶。泳道1含有大小标准品，在左侧表明了根据该标准品的以kDa表示的分子 量。泳道2 : Δ 108 hST6Gal-I截短变体(在凝胶上，上样5 μ8)。
[0018] 详述 除非上下文另行明确指出，否则术语"一个/种"和"所述"通常包括多个指代物。如 本文中所用，"多个"被理解为多于一个。例如，"多个"是指至少两个、三个、四个、五个或更 多个。除非特别说明或在上下文中显而易见，如本文中所用，术语"或"被理解为包括性的。
[0019] 除非特别说明或在上下文中显而易见，如本文中所用，术语"