产l-苏氨酸微生物和使用该微生物生产l-苏氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及RNA聚合酶〇 32因子变体，并且涉及使用该微生物生产L-苏氨酸的 方法。
【背景技术】
[0002] L-苏氨酸，是一种必需氨基酸，被广泛用作动物饲料和食品的添加剂，并且被有效 用作医药和制药用再水化溶液和合成材料。
[0003] L-苏氨酸主要通过使用人工突变方法或基因重组方法开发的大肠杆菌 (Escherichia coli)或棒状杆菌（Corynebacterium)发酵生产。源自野生型菌株（包括大 肠杆菌（Escherichia coil)、沙雷菌（Serratia)、普罗威登斯菌（Providencia)或棒状杆 菌）的人工突变菌株被广泛用于生产L-苏氨酸。
[0004] 随着基因重组技术的发展，通过随机突变操纵具有L-苏氨酸生产力的菌株的技 术已经被报道为用于提高L-苏氨酸生产力的位点特异性基因置换、基因扩增与缺失等。已 开发了与苏氨酸的生物合成有关的基因和用于增加这些基因表达的各种方法。但是仍然需 要能够以高产量生产L-苏氨酸的方法。
[0005] 全局转录机器的功能是控制所有细胞系统（原核的和真核的）的转录。全局转录 机器工程通过突变编码全局性调控因子的核酸或控制其表达的启动子而提供包含特性改 进的全局性调控因子的重组细胞，并且可通过该方法生产表型改进的细胞。
[0006] σ因子为一类基于RNA聚合酶全酶的启动子偏好在调控全局转录中发挥重要作 用的全局性调控因子。σ因子是能使RNA聚合酶特异性结合到基因启动子的原核生物的转 录起始因子。每个σ因子响应不同的环境条件而激活，并且每个RNA聚合酶分子都包含一 个〇因子亚基。众所周知，大肠杆菌（E.coli)具有至少8个σ因子，并且σ因子的数量 变化取决于细菌种类。
[0007] 为了进一步增强具有L-苏氨酸生产力的大肠杆菌菌株的耐高温压力，本发明人 已经进行了研究以修饰编码已知控制热激应答的σ 32的rpoH基因。因此，本发明人已经 研发了调控转录机制的RNA聚合酶σ 32因子变体，使得苏氨酸生产力即使在高温下也没有 极大降低，并且已经将RNA聚合酶σ 32因子变体引入到产苏氨酸菌株中，从而完成本申请。
【发明内容】
[0008] 抟术问题
[0009] 本申请的目的是提供RNA聚合酶σ 32因子变体。
[0010] 本申请的另一个目的是提供编码RNA聚合酶〇32因子变体的核苷酸序列。
[0011] 本申请的又另一个目的是提供包含所述核苷酸序列的载体。
[0012] 本申请的又另一个目的是提供具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属 (Escherichia)的重组微生物，其表达所述变体。
[0013] 本申请的又另一个目的是提供使用所述埃希氏杆菌属的微生物生产L-苏氨酸的 方法。
[0014] 抟术方案
[0015] 为了完成上述目的，本申请提供了具有SEQ ID N0:17所示的氨基酸序列的RNA聚 合酶σ 32因子变体。
[0016] 本申请也提供了编码RNA聚合酶σ 32因子变体的核苷酸序列。
[0017] 本申请也提供了具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属的重组微生物，其表达所 述变体。
[0018] 本申请也提供了使用所述埃希氏杆菌属的微生物生产L-苏氨酸的方法。
[0019] 有益效果
[0020] 根据本申请，用包含编码耐高温应激的RNA聚合酶σ 32因子变体的核苷酸序列的 载体转化的菌株具有耐温性并且也可以增加的产量生产L-苏氨酸。因此，与常规菌株相 比，即使当在高温下培养时，它可以显著高的生产力生产苏氨酸。因此，它能被有效用于以 高产量生产苏氨酸。
[0021] 发明详沐
[0022] 下文将详细描述本申请。
[0023] 本申请提供了具有SEQ ID Ν0:17所示的氨基酸序列的RNA聚合酶σ 32因子变体。
[0024] 本文所用的术语"σ 32(〇32)因子"指的是称为主要σ因子的全局性调控σ因 子，其在对数期控制热激应答并且由rpoH基因编码。
[0025] 此外，与本申请变体的氨基酸序列具有至少80%，特别是至少90%，更特别是至 少95 %，并且尤其特别是至少99 %同源性的变体也包括在本申请的范围内。通过利用，例 如 Karlin 和 Altschul 的 BLAST 算法（参见 Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))或 FASTA(参见Methods Enzymol.，183, 63(1990))可以测定氨基酸序列的同源性。已经在该 BLAST算法(参见www. ncbi.nlm. nih. gov)的基础上开发了称为BLASTN和BLASTX的程序。 本申请的变体的范围包括与所述变体的氨基酸序列相比具有缺失、插入和氨基酸取代等的 突变体，并且也包括具有密码子取代的突变体。
[0026] 在本申请的实施方案中，变体选自通过将随机突变引入野生型大肠杆菌菌株 W3110中而获得的突变rpoH DNA库，并且选择的变体命名为rp〇H2G6。分析提取的变体的 核苷酸序列，并且结果是，可以看出与野生型RNA聚合酶σ 32因子的氨基酸序列（SEQ ID NO: 16)相比，在变体的氨基酸序列中发生了突变（实施例3)。
[0027] 本申请还提供了编码所述变体的核苷酸序列。
[0028] 在本申请的实施方案中，RNA聚合酶σ 32因子变体可特别具有SEQ ID N0:15所 示的核苷酸序列。
[0029] 在本申请的实施方案中，编码所述变体的核苷酸序列的遗传密码可以是简并的。 在本文中，遗传密码简并性是在遗传密码中最后一个碱基是无意义的现象。如果开始两个 碱基是相同的，即使当在该位置的密码子是不同的，它们编码相同。
[0030] 因此，本申请的变体的核苷酸序列可与SEQ ID N0:15所示的核苷酸序列具有至少 80 %，特别是至少90 %，更特别是至少95 %，最特别是99 %的同源性。
[0031] 本申请也提供了包含所述核苷酸序列的载体。
[0032] 本申请所用的载体并无特别限制，并且可以是本领域已知的任何载体，只要它可 以在宿主中复制即可。通常使用的载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。 例如，本申请所用的噬菌体载体或粘粒载体可以是pWE15、M13、XMBL3、XMBL4、λΙΧΙΙ、 AASHII、λΑΡΙΙ、AtlO、人1：11、〇1&1'〇1144、〇1&1'〇112]^等，并且本申请所用的质粒载体可以 是pBR类型、pUC类型、pBluescriptll类型、pGEM类型、pTZ类型、pCL类型、pET类型等。 本申请所用的载体并无特别限制，并且可以是本领域已知的任何表达载体。具体而言，可以 使用 PACYC177 载体、pACYC184 载体、pCL 载体、pECCG117 载体、pUC19 载体、pBR322 载体、 PMW118载体或pCCIBAC载体。最特别是，可以使用pACYC177载体、pCL载体或pCCIBAC载 体。
[0033] 本申请提供了具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属的重组微生物，其表达所述 变体。
[0034] 在本申请中，所述变体的表达可通过用可操作地包含编码所述变体的基因的重组 载体转化或通过将编码所述变体的多核苷酸插入到微生物的染色体中而获得，但是不特别 限于此。
[0035] 本文所用的术语"转化"意思是将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主 细胞，从而能够在宿主细胞中表达所述多核苷酸编码的蛋白。可以使引入的多核苷酸插入 或位于宿主细胞的染色体中或染色体外，只要它能在宿主细胞中表达即可。此外，多核苷酸 包括编码靶蛋白的DAN和RNA。只要多核苷酸可以被引入宿主细胞并且可以在其中表达，它 就可以以任何形式被引入。例如，可以以包括自我表达所需的所有元素的多核苷酸构建体 的表达盒的形式将多核苷酸引入到宿主细