β－1，3－葡聚糖酶、多核苷酸、重组载体、转化体、β－1，3－葡聚糖酶的制造方法、酶制剂 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分解裸藻淀粉的新型的β-1，3-葡聚糖酶、多核苷酸、重组载体、转化 体、β-1，3-葡聚糖酶的制造方法、酶制剂及低分子化裸藻淀粉的制造方法。
【背景技术】
[0002] β-1，3 -葡聚糖是以葡萄糖的β-1，3-键作为主链的多糖，是作为在褐藻、海带 属中大量含有的褐藻淀粉、土壤细菌(Alcaligenes faecal is)的突变株在细胞外形成的可 得然胶的主结构存在的物质。另外，还已知有粮谷的细胞壁中所含的胼胝质（加一只）。
[0003] 虽然β-1，3-葡聚糖在以β-1，3-结构为主链这一点上是共同的，然而根据其来 源等，分支的侧链的有无和位置、β-1，4一键、β-1，6-键的组合、分子的大小等不同，分别 具有不同的结构、性质。
[0004] β- 1，3-葡聚糖酶是将这些β-1，3-葡聚糖水解的酶，除了用于改善家畜的生 长、饲料利用率的饲料的添加剂、糕点/面包等的物性改善剂或口感改良剂、酵母提取物的 提取效率改良剂、啤酒的过滤效率的改善剂外，还被用于各种用途中。
[0005] 作为β- 1，3-葡聚糖酶，有各种来源、底物特异性的β- 1，3-葡聚糖酶，已知有对 褐藻淀粉、可得然胶、或酵母细胞壁、香菇菌糸、パス卜yッ等显示出分解活性的β-1，3-葡 聚糖酶(专利文献1~3)。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1:日本特开2005 - 34146号公报 [0009] 专利文献2:日本特开2005 - 224230号公报 [0010] 专利文献3:日本特表平10 - 507078号公报
[0011]然而，还不知道有对于作为β-1，3-葡聚糖的一种的、来自于裸藻属的裸藻淀粉 显示出分解活性的分解酶。
[0012] 裸藻淀粉在β-葡聚糖中，具有仅由β-1，3 -键构成的特征。另外，裸藻淀粉在所 有的种、变种的裸藻细胞内作为颗粒存在，其个数、形状、粒子的均匀性根据种不同而具有 特征。虽然可以期待与其他的β-葡聚糖同样地具有功能性，然而其作用机理有很多未知的 方面。
[0013] 此外，无论是分解裸藻淀粉的分解酶，还是分解裸藻淀粉而得的组合物都不为人 所知。
[0014] 另外，作为可以替代石油之类的耗竭性资源的非耗竭性资源，利用了属于地域性 未利用资源的生物质等的能源供给体制的强化得到推进。
[0015]所谓生物质，被定义为可以再生的、来自于生物的有机性资源，且为除去化石资源 以外的资源。是由生物使用太阳能合成的物质，是只要存在有生命和太阳就不会枯竭的资 源，是指即使焚烧等也不会增加大气中的二氧化碳的碳中性的资源。
[0016] 作为利用了生物质的能源之一，生物乙醇的开发正在推进之中。生物乙醇是通过 如下操作而制造，即，对甘蔗/玉米等的糖、或将米/麦/玉米等淀粉系原料用酶糖化了的物 质、或将间伐材/建筑废料/稻草/甘蔗渣等的纤维素系原料用加压热水/酸/碱进行前处理、 并用糖化酶等糖化了的物质，进行乙醇发酵、蒸馏、脱水，由此可以制造(农林水产省生物质 事业化战略(平成24年9月6日）参考资料主要技术的概要）。
[0017] 石油等化石燃料储量多，被全球性地稳定供给。与之不同，生物乙醇由于原料不能 与粮食竞争、耕地面积不能侵犯粮食用的耕地等涉及可持续性的要求，多使用废料等作为 原料，在现实状况下，很难取得可以全球性地、或者一国整体性地稳定供给的供给量。由此， 一般而言，按照地域进行利用了生物质等的能源供给的对策受到推进。
[0018] 生物乙醇在一部分地域中已经被实用化，然而与石油等化石燃料相比价格竞争力 差，另外，在稳定供给、可持续性的方面存在有问题，因此现实状况是，在日本国内还没有充 分地普及，希望开发出在成本方面、稳定供给/可持续性的方面能够实用化的生物乙醇的原 料。
[0019] 另一方面，裸藻虽然过去被认为难以大量培养，然而近年来，由于本发明人等的深 入研究，确立了大量培养技术，开辟出裸藻淀粉的大量供给的道路。由此，希望开发出来自 于已经能够大量供给的裸藻的功能性物质。
【发明内容】
[0020] 发明所要解决的问题
[0021] 本发明是鉴于上述的问题而完成的，本发明的目的在于，提供对来自于裸藻属的 裸藻淀粉显示出分解活性的β-1，3-葡聚糖酶。
[0022] 本发明的另一个目的在于，提供可以作为将来自于裸藻属的裸藻淀粉转变为生物 乙醇原料的裸藻淀粉分解酶利用的β-1，3-葡聚糖酶。
[0023] 本发明的另一个目的在于，开发来自于已经能够大量供给的裸藻的新的功能性物 质。
[0024] 用于解决问题的方法
[0025] 本发明人等进行了深入研究，结果发现，可以由裸藻属得到具备裸藻淀粉分解活 性的新型的β-1，3-葡聚糖酶，从而完成了本发明。
[0026] 如前所述，蓄积裸藻淀粉的裸藻过去被认为难以大量培养，然而近年来，根据本发 明人等的深入研究，确立了大量培养技术，开辟出裸藻淀粉的大量供给的道路。另外，裸藻 淀粉的大量生产可以在裸藻的培养槽中进行，不像甘蔗/玉米等那样需要广大的农地，此 外，由于不是现在的粮食，因此在可持续性的方面也没有问题。而且，由于裸藻的生产效率 好，因此被期待供给稳定性也能够得到保证，作为生物乙醇的原料的候补受到期待。
[0027] 另外，由于裸藻淀粉是仅由β- 1，3-键构成的直链状的多糖，因此与纤维素系原 料相比，可以简化糖化工序。
[0028] 所述问题通过来自于裸藻(Euglena)属、显示出以下的性质的β- 1，3 -葡聚糖酶 解决。
[0029] (1)作用:水解0-1，3 -葡聚糖的0-1，3 -键。
[0030] 也可以采用还显示出以下的性质的β-1，3-葡聚糖酶。
[0031] (2)底物特异性:至少分解裸藻淀粉。
[0032] (3)分解活性:裸藻淀粉分解活性相对于海带多糖分解活性的比率为20%以上。
[0033] (4)最适 ρΗ:3·7 ~7.0。
[0034] (5)最适温度：30 ~70°C。
[0035] (6)分解活性:裸藻淀粉分解活性相对于碱溶胀裸藻淀粉分解活性的比率为25% 以上。
[0036] 由于发现了来自于因近年来的本发明人等的研究而能够大量供给的裸藻的新型 的β-1，3-葡聚糖酶，而开辟出裸藻的新的有效利用的道路。已知β-葡聚糖酶的底物特异 性等性质根据其来源而不同，由于发现了来自于裸藻的β-1，3-葡聚糖酶，而开辟出新型 的低分子化葡聚糖和其制造方法，进而开辟出使用了新型的低分子化葡聚糖的通向新型的 生物乙醇原料的供给的道路。
[0037] 也可以除了分解所述裸藻淀粉以外，还具有将碱溶胀裸藻淀粉及海带多糖分解的 底物特异性，1小时以内的反应时间对应的最适温度为50°C以上，从1小时到2小时的反应时 间对应的最适温度为40°C以上，20小时以上的反应时间对应的最适温度为60°C以下。
[0038] 另外，所述问题可以利用包含下述(a)或(b)的任意一个的氨基酸序列的β-1，3 - 葡聚糖酶解决。
[0039] (a)以序列编号2、4或6表示的氨基酸序列；
[0040] (b)在以序列编号2、4或6表示的氨基酸序列中，缺失、取代或附加了 1个或多个氨 基酸、且具有β- 1，3 -葡聚糖的β- 1，3 -键的水解活性的氨基酸序列。
[0041] 另外，所述问题可以利用包含以下的(a)或(b)的碱基序列的多核苷酸解决。
[0042] (a)以序列编号1、3或5表示的碱基序列；
[0043] (b)在以序列编号1、3或5表示的碱基序列中，缺失、取代或附加了1个或多个碱基、 且将具有β-1，3-葡聚糖的β-1，3 -键的水解活性的蛋白质编码的碱基序列。
[0044] 此时，也可以是包含所述多核苷酸的重组载体。
[0045] 另外，也可以是具有所述重组载体的转化体。
[0046] 另外，也可以是一种β-1，3 -葡聚糖酶的制造方法，其特征在于，在培养基中培养 所述转化体，使培养物中生成蓄积所述β- 1，3-葡聚糖酶，从所述培养物中采集所述β- 1， 3-葡聚糖酶。
[0047] 也可以是用于将裸藻淀粉低分子化的酶制剂，其特征在于，含有所述β- 1，3-葡 聚糖酶。
[0048] 也可以是一种低分子化裸藻淀粉的制造方法，其特征在于，使所述β- 1，3-葡聚 糖酶作用于裸藻淀粉，生成低分子化裸藻淀粉。
[0049] 此时，也可以使葡糖苷酶与所述β- 1，3 -葡聚糖酶一起作用于所述裸藻淀粉，作 为所述低分子化裸藻淀粉的主生成产物，生成葡萄糖。
[0050] 发明效果
[0051] 根据本发明，可以将裸藻淀粉水解，得到包含直链寡糖、具有功能性的新型的低分 子化裸藻淀粉。
[0052] 另外，根据本发明，由于可以将包括裸藻淀粉在内的β-1，3-葡聚糖水解，因此通 过将本发明的低分子化裸藻淀粉的制造方法作为生物乙醇的糖化工序使用，就可以将裸藻 淀粉等β- 1，3-葡聚糖作为生物乙醇的原料。
【附图说明】
[0053] 图1是表示裸藻破碎溶液的借助疏水柱的海带多糖分解活性部分的分离的图表。
[0054] 图2是表示裸藻破碎溶液的借助凝胶过滤柱的海带多糖分解活性部分的分离的图 表。
[0055] 图3是表示裸藻破碎溶液的借助阴离子交换柱的海带多糖分解活性部分的分离的 图表。
[0056] 图4是裸藻破碎溶液的海带多糖分解活性部分的SDS-PAGE的凝胶的银染色。
[0057] 图5是重组EgCe 117Α的SDS-PAGE的凝胶的CBB染色图像。
[0058]图6是表示作为本发明的一个实施例的酶EgCe 117A的底物特异性的图表。
[0059]图7是表示作为本发明的一个实施例的酶EgCe 117A的最适温度的图表。
[0060]图8是表示将作为本发明的一个实施例的酶EgCell7A在30 - 70°C温育1 一 20小时 的情况下的海带多糖分解活性的图表。
[0061]图9是表示作为本发明的一个实施例的酶EgCe 117A的最适pH的图表。
[0062]图10是表示木霉纤维素酶标准品与作为本发明的一个实施例的酶EgCell7A的裸 藻淀粉分解活性的图表。
[0063]图11是表示枯草菌葡聚糖酶与作为本发明的一个实施例的酶EgCell7A的裸藻淀 粉分解活性的图表。
[0064]图12是表示BSA添加量对作为本发明的一个实施例的酶EgCell7A的活性造成的影 响的图表。
[0065]图13是表示金属添加量对作为本发明的一个实施例的酶EgCe 117A的活性造成的 影响的图表。
[0066]图14是表示裸藻的碱处理的条件对作为本发明的一个实施例的酶EgCell7A的活 性造成的影响的图表。
[0067] 图15是表示氯化钠的添加量对作为本发明的一个实施例的酶EgCell7A的活性造 成的影响的图表。
[0068] 图16是纸层析的结果，表示作为本发明的一个实施例的酶EgCell7A对海带多糖和 海带寡糖的分解活性及转糖基活性。
[0069]图17是表示向碱溶胀裸藻淀粉中添加 EgCell7A、MoCel3A而使之反应的反应产物 的HPLC的结果的图表。
[0070]图18是薄层层析的结果，表示作为本发明的一个实施例的酶EgCell7A对海带寡糖 的分解活性及转糖基活性。
[0071 ] 图19是表示重组EgCel81A的免疫印迹(western-blot)的结果的图像。
[0072]图20是表示重组EgCelSlA的各多糖的水解活性测定试验的结果的图表。
【具体实施方式】
[0073]以下，对本发明进行详细说明。
[0074]本发明涉及来自于裸藻(Euglena)属的β-1，3-葡聚糖酶。
[0075]在本发明的β-1，3-葡聚糖酶中，包含具有裸藻属所产生的裸藻淀粉的分解活性 的蛋白质。
[0076]裸藻淀粉(Paramylon)是约700个葡萄糖利用β- 1，3-键聚合而得的高分子体 ⑴一 1，3 -葡聚糖），是裸藻属所含有的贮藏多糖。裸藻淀粉粒子是扁平的回转椭圆体粒子， 是β- 1，3-葡聚糖链以螺旋状缠绕而形成。
[0077] 裸藻淀粉粒子被从所培养的裸藻属中以任意的合适方法分离并纯化为微粒状，通 常被作为粉末体提供。
[0078] 例如，裸藻淀粉粒子可以通过（1)在任意的合适培养基中的裸藻细胞的培养；（2) 裸藻细胞从该培养基中的分离；（3)裸藻淀粉从分离出的裸藻细胞中的分离；（4)被分离出 的裸藻淀粉的纯化；以