用于无标记检测dna、micro-rna和dna/rna结合生物标志物的交换诱导剩余磁化的制作方法
【技术领域】
[0001]本公开内容涉及miRNA分析(profiling)和生物标志物检测领域。
【背景技术】
[0002]核苷酸是形成核酸(DNA和RNA)的结构单元(building block)和用于携带细胞内能量包(ATP)的生物分子。核苷酸以三磷酸核苷(ATP、GTP、CTP和UTP)的形式在代谢中发挥核心作用。此外，核苷酸参与细胞信号传导(cGMP和cAMP)且被掺入酶促反应的重要辅因子(例如辅酶A、FAD、FMN、NAD和NADP+)中。核苷酸也可包含合成序列，以及包含对核苷酸结构的化学修饰以产生例如核苷酸类似物。
[0003]DNA和RNA是生命必不可少的生物分子。遗传信息被编码为特定序列的DNA分子。通过信使RNA，信息在转录和蛋白质合成的过程中传递着。因此，它们密切相关的，并与多种类型的疾病(例如癌症)相互影响。
[0004]特别地，miRNA在基因调控中发挥重大作用，因此是一类主要的用于癌症诊断的生物标志物。由于他们的短链和多样的表达水平，实现精确和定量检测在技术上仍然具有挑战。miRNA是含有18至25个核苷酸的短的RNA链，发挥许多重要的作用，包括在基因表达、发育和细胞分化中的那些作用(1-3)。成熟的miRNA并入RNA诱导的沉默复合物中，所述复合物基于部分序列互补性与信使RNA结合并由此导致对蛋白质翻译的抑制。miRNA的调控作用取决于miRNA的序列、表达水平以及与其他miRNA的合作。因此，灵敏且特异性地检测miRNA是理解miRNA在蛋白质合成、细胞死亡中的作用以及其作为疾病的生物标志物作用的一个必要步骤。
[0005]已经使用了一系列技术来进行miRNA分析。已知的方法包括northern印迹(4)、逆转录聚合酶链式反应(5)、原位杂交(6)、微阵列(7)、生物发光(8)、表面等离子体共振
(9)、表面增强拉曼光谱(10)、电化学检测(11)、荧光(12)和光子学方法(13);然而，没有一种技术可单独地实现高灵敏度、单碱基特异性以及宽动态范围。此外，由于在分析中涉及许多步骤和多种方案(14)，当比较来自不同技术的结果时，重现性仍然是一个显著问题。因此，在该领域对可检测短核苷酸序列(例如miRNA)的具有高灵敏度、高特异性以及宽动态范围的单一技术具有未能满足的需求，该单一技术可以是促进高可靠性且需要最小量的生化试剂的一步法。
[0006]因此，产生能够精确检测短核苷酸序列(DNA或RNA序列，例如miRNA)的具有高灵敏度、高特异性以及宽动态范围的方法将特别受欢迎，并且认为本文提出的方法的实施方案通过使用交换诱导剩余磁化(exchange-1nduced remnant magnetizat1n, EXIRM)技术
(15)克服了上文所述的某些局限性。此外，许多癌症生物标志物可特异性地与短链DNA结合，例如前列腺特异性抗原(16)。可直接改进EXIRM方法以实现对这类癌症生物标志物的灵敏且无标记的检测。
[0007]实施方案概述
[0008]本公开内容涉及一种使用交换诱导剩余磁化(EXIRM)技术来检测短链核苷酸的方法，所述短链核苷酸例如为包括脱氧核糖核酸(DNA)的短链核苷酸；以及包括核糖核酸(RNA)(包括microRNA (miRNA))的短链核苷酸，所述方法具有高灵敏度、高特异性以及宽动态范围。此外，本文描述的方法也可以是促进高可靠性且需要最小量的生化试剂的一步法。2013年4月10日提交的美国临时申请序列号61/810，575通过引用全部并入本文。
[0009]本文描述的某些实施方案解决了这样的需求，并在无标记的核苷酸序列(例如miRNA)和磁性标记的核苷酸序列(例如RNA，miRNA或DNA)之间(在一些实施方案中有一个碱基的区别)使用序列特异性交换反应。在一个实施方案中，交换诱导剩余磁化(EXIRM)以单碱基特异性定量地测量靶miRNA，在一些实施方案中，这类靶miRNA的检测限达到10-21摩尔(zeptomolar)水平。在另一个实施方案中，可以平行地检测两个仅具有一个碱基差异的miRNA，而不显示出磁信号的交叉干扰(cross-talking)，在又一个实施方案中，用EXIRM技术分析miRNA而不用任何扩增或冲洗步骤。在一些实施方案中，本文描述的EXIRM方法适于精确地分析miRNA以用于癌症的早期诊断和精确预后。该方法也可以扩展，其中一些实施方案中需要进行定量测量的目的样品可包含蛋白质或其衍生物，在另一个实施方案中，样品可包含抗体。而且，这样的测量也可在生物环境中直接进行，例如但不限于血浆、尿或细胞裂解物和/或光学检测受限的其他环境。
[0010]在一个实施方案中，检测核苷酸序列的方法包括:a)将第一核苷酸单链固定在表面上；b)向所述第一核苷酸单链添加第二核苷酸单链以形成杂交的双链，其中所述第二链包含:第一磁性颗粒；和与所述第一核苷酸单链互补性小于100%且包含至少第一错配碱基的核苷酸序列；c)测量所述杂交双链的第一磁信号值；d)将第三核苷酸链与所述杂交双链一起孵育；其中，所述第三链与所述第一链互补，且其中孵育形成交换产物；e)测量步骤d的交换产物的第二磁信号值；以及f)从在步骤c和步骤e中测得的磁信号值的差值来量化所述第三核苷酸链的量。
[0011]在检测核苷酸序列的方法的一些实施方案中，第一核苷酸单链是衍生化的；在一些其他实施方案中，第一核苷酸链可以是生物素化的或硫醇捕获的。在检测核苷酸序列的方法的另一个实施方案中，第一核苷酸链通过S-Au共价键固定到所述表面上。在检测核苷酸序列的方法的另一个实施方案中，磁性颗粒通过链霉亲和素-生物素共价键附着至第二核苷酸链上。在另一个实施方案中，磁性颗粒的大小(例如，球形磁性颗粒的直径)为约lnm至约10 μ m。在另一个实施方案中，大小为约10nm至约5 μ m。在另一个实施方案中，磁性颗粒的大小为约3 μ m。
[0012]在检测核苷酸序列的方法的另一个实施方案中，测量包括原子磁力计；在另一个实施方案中，第一磁信号值和第二磁信号值包括磁矩测量值(17)，在检测核苷酸序列的方法的另一个实施方案中，步骤(f)包括测量磁信号的变化(AB)，在另一个实施方案中，可计算第三核苷酸链的摩尔浓度，其中所述摩尔浓度与A B或与磁矩测量值的变化线性相关。在检测核苷酸序列的方法的一些实施方案中，量化还包括计算游离磁性颗粒标记物的数目，其中所述游离磁性颗粒的数目对应于交换产物分子的数目。
[0013]在检测核苷酸序列的方法的一些实施方案中，所述表面是在样品架上。在一个实施方案中，杂交双链序列是在液体环境中。在另一个的实施方案中，所述环境是细胞裂解物，而又一个实施方案中，所述环境是血浆，而另一个实施方案中，所述环境是尿液。
[0014]在检测核苷酸序列的方法的一些实施方案中，第一核苷酸链是RNA或DNA序列，在另一个实施方案中，第三核苷酸链是DNA或microRNA序列。在一些实施方案中，第一核苷酸链的长度为约1至100个核苷酸，在另一些实施方案中，第二核苷酸链的长度为约1至100个核苷酸，在另一些的实施方案中，第三核苷酸链的长度为约1至100个核苷酸。
[0015]在一些实施方案中，第一核苷酸链的长度为约10至50个核苷酸，在另一些实施方案中，第二核苷酸链的长度为约10至50个核苷酸，在又一些实施方案中，第三核苷酸链的长度为约10至50个核苷酸。
[0016]在一些实施方案中，第一核苷酸链的长度为约18至25个核苷酸，在另一些实施方案中，第二核苷酸链的长度为约18至25个核苷酸，在又一些实施方案中，第三核苷酸链的长度为约18至25个核苷酸。在一些实施方案中，第一核苷酸链的长度为约18至25个核苷酸，在另一些实施方案中，第二核苷酸链被DNA/RNA结合生物标志物所替换，在又一些实施方案中，第三核苷酸链的长度为约18至25个核苷酸。
[0017]在检测核苷酸序列的方法的另一些实施方案中，交换产物在热力学上比杂交双链更稳定，在一些实施方案中，双链比所述交换产物不稳定12pN(PN:10 12N)。
[0018]在另一个实施方案中，提供了同时检测异源核苷酸序列之阵列的方法，其中所述方法包括:(a)包被包含隔室的阵列的样品孔；其中相邻隔室的表面交替地:i)包被有杂交核苷酸双链；和ii)未包被；其中所述未包被的隔室不产生磁信号；且各包被的隔室包含异源的杂交双链序列；(b)测量各隔室的磁信号；(c)用包含游离的靶核苷酸序列的样品孵育所述阵列，并形成交换产物；(d)在施加弱机械力以除去非特异性结合的磁性颗粒后，测量包含交换产物的各隔室的磁信号；(e)计算来自步骤b和d的所述信号的差值；以及(f)基于在步骤(e)中所计算的信号的变化来定量和鉴定所述靶序列。在同时检测异源核苷酸序列阵列的方法的另一个实施方案中，通过用于同时检测的扫描单传感器、扫描样品孔、二维传感器阵列或其组合来测量来自样品阵列的磁信号。
[0019]在另一个实施方案中，本文描述了用于检测特定核苷酸序列的交换诱导剩余磁化方法，所述方法包括:(a)将第一单链序列固定在表面上；其中所述第一序列包含N个碱基；(b)向第一单链序列添加第二单链序列，其中所述第二单链序列包含N-1个互补碱基；其中，所述互补碱基与第一单链序列的序列互补，且其中所述第二单链序列与所述第一单链序列杂交形成具有N-1个碱基对的杂交的双链序列；以及(c)使杂交的双链序列与第三单链序列一起孵育，其中所述第三单链序列包含N个互补碱基，其中所述互补碱基与第一单链序列的序列互补；并且其中所述第三单链序列与所述第二单链序列交换以形成包含具有N个互补碱基对的双链的交换产物；其中所述交换产物在热力学上比所述杂交双链序列更稳定。另一些实施方案可包括其中第二单链序列具有多于一个互补碱基错配的种类。在另一个实施方案中，本文描述了用于检测特定生物标志物的交换诱导剩余磁化方法，所述方法包括:(a)将第一单链序列固定在表面上；其中所述第一序列包含N个碱基；(b)向第一单链序列添加第二单链序列，其中所述第二单链序列包含N个互补碱基；其中所述互补碱基与第一单链序列的序列互补，且其中所述第二单链序列与第一单链序列杂交形成具有N个碱基对的杂交双链序列；以及(c)用生物标志物孵育所述杂交双链序列，其中所述生物标志物与所述第二单链序列交换以形成包含DNA-生物标志物复合物的交换产物；其中所述交换产物在热力学上比所述杂交双链序列更稳定。另一些实施方案可包括其中所述第二单链序列被一个或更多个互补碱基错配的种类。
[0020]因此，本文描述的实施方案包括旨在解决与检测核苷酸序列(例如DNA和microRNA序列)相关之多种缺点的特征和特性的组