T细胞表位肽p2及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学技术领域，特别涉及结核分枝杆菌特异性CD4+T细胞表位肽及其应用。
【背景技术】
[0002]结核病是由结核分枝杆菌感染后诱发、全球感染率最高的传染病，病死率仅次于艾滋病。仅2012年，全球新发结核病患者达860万，死亡130万。结核病疫情的新特点在于:耐药结核病例出现并呈蔓延之势;结核与艾滋病共感染情况愈演愈烈。针对这两类患者，目前并无有效的防治措施。中国是世界上结核病负担最重的国家之一，研发适合中国人群的结核病疫苗和治疗药物已时不我待。
[0003]结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是胞内寄生菌，对其有效控制主要依赖于细胞免疫，尤其是T细胞免疫。人体内T细胞主要分为CD4+T(Th)细胞和CD8+T(CTL)细胞两大亚群，大量研究已经证明，这两种T细胞亚群对于控制结核菌感染都具有重要作用。CD4+T细胞被认为是人类抗结核感染的最重要的媒介。人类主要组织相容性抗原MHCII能够递呈将结核分枝杆菌肽表位，进而激活⑶4+T细胞，并且主要为Thl型⑶4+T细胞，后者继而分泌IFN-γ、TNF-a和IL-2等细胞因子，加强抗原递呈细胞和CD8+T细胞的活性，促进其对结核分枝杆菌的清除。
[0004]T细胞无法识别完整的结核菌和蛋白抗原，而是识别经过抗原递呈细胞摄取和加工后释放出的结核表位肽。表位肽是抗原中引起免疫应答的核心部份，也称为抗原决定簇，它与抗原递呈细胞表面的HLA分子结合形成肽-HLA复合物并被递送和表达在抗原递呈细胞表面，进而活化T细胞，诱发T细胞免疫反应。CD4+T细胞识别HLA 11类分子递呈的表位肽，而CD8+T细胞识别HLA I类分子递呈的表位肽。T细胞对表位肽的识别及其活化要求表位肽与抗原递呈细胞表面HLA分子稳定结合，而肽与HLA分子的亲和力是形成肽-HLA复合物的关键，因此制备诱发T细胞免疫的治疗药物和疫苗，首要步骤是筛选出高亲和力的肽，进而鉴定出具有免疫活性的表位肽。
[0005]表位肽可以完全通过人工合成获得，研发周期短；由于剔除了表位肽以外病原体其他有害成分，安全性良好;还可以将多个表位肽串联使用，加强免疫效果和减少免疫逃逸。目前已知的结核菌表位肽主要是在欧美人群中鉴定，多为HLA-A*0201限制性，而对于结核病流行最严重的非洲和东南亚人群，并没有合适的表位肽可使用。在中国，HLA-DRB1*09:01是人群中基因频率最高的HLA分子，鉴定HLA-DRBI *09:01限制性Th I表位对于研发适合中国人群的表位肽疫苗具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌特异性CD4+T细胞表位肽。
[0007]本发明的另一目的在于提供该结核分枝杆菌特异性CD4+T细胞表位肽在制备结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物中的应用。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
一种结核分枝杆菌特异性CD4+T细胞表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]上述表位肽在制备结核病疫苗中的应用。
[0010]上述表位肽在制备结核病诊断试剂盒中的应用。
[0011 ]上述表位肽在制备治疗结核病药物中的应用。
[0012]本发明的有益效果是:
本发明提供了与HLA-DRB1*09:01分子亲和力高，能活化CD4+T细胞、诱导其增殖和分泌IFN- γ的结核分枝杆菌特异性CD4+T细胞表位肽Ρ2。
[0013]本发明综合利用生物信息学、免疫信息学的技术手段，利用结核分枝杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核活性的表位肽，其中筛选出的表位肽Ρ2与HLA-DRB409:01分子之间具有高亲和力。该表位肽是新的、未被报道过的HLA-DRB1*09:01限制性结核分枝杆菌表位肽，可被结核病人CD4+T细胞广泛识别。由于HLA-DRB 1*09:01基因型是中国人中广泛携带的基因型之一，目前并未发现结核分枝杆菌特异的HLA-DRB1*09:01限制性Thl表位肽，本发明表位肽P2的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。
【附图说明】
[0014]图1为P2的质谱分析图；
图2为表位肽P2诱导结核患者T细胞活化并分泌IFN- γ的示意图；
图3为ELISPOT检测Ρ2诱导结核患者表位肽特异T细胞的频率；图中DRB1*0901—表示非HLA-DRB1*0901 结核患者；
图4为CFSE标记增殖实验检测P2诱导结核患者表位肽特异CD4+T细胞增殖，图中W/0表示对照组。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。
[0016]实施例1:HLA-DRB1*09:01限制性表位肽的获得
本发明从HLA基因频率数据库AFND(AlIele Frequency Net Database, AFND)上获得中国人群HLA-DRBI位点各基因型的频率分布信息，其中HLA-DRBI基因频率约为15%，SHLA-DRBl位点上频率最高的单个基因型。使用生物信息学算法预测抗原蛋白所含的HLA-DRB1*09:01限制性⑶4+T细胞表位。
[0017]本发明综合利用各种生物信息学、免疫信息学的技术手段，对结核分枝杆菌抗原蛋白序列上所含的HLA-DRB1*09:01限制性CD4+T表位肽进行预测分析，通过大量的筛选，筛选出与HLA分子具有高亲和力的表位肽，并通过免疫学实验鉴定。筛选结果发现CD4+T表位肽P2可诱导⑶4+T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ，并诱导⑶4+Τ细胞发生显著增殖。
[0018]表位肽Ρ2的氨基酸序列为DQVHFQPLPPAVVKL(SEQ ID NO:1)，其质谱分析图如图1所示。
[0019]表位肽Ρ2与HLA分子的亲和力使用IC50值表示，IC50值越低，则表位肽与HLA分子亲和力越高，其中通常认为IC50值低于50nM即表示高亲和力。而表位肽P2与HLA分子的IC50值为0.17nM，可见表位肽P2与HLA分子间具有极高的亲和力。
[0020]实施例2:ELISA实验检测表位肽P2诱导T细胞分泌IFN- γ 实验方法如下:
采用密度梯度法分离HLA-DRB1*09:01基因型结核患者外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear, PBMC)。将收集的20ml外周血用PBS稀释一倍，缓慢加入淋巴细胞分离液上方，两者体积比为2:1，然后以800g/min转速离心30min，离心后液体分为三层，其中PBMC在第一层和第二层之间，成白膜状，用滴管小心吸取PBMC至新的离心管中，加入5倍以上体积TOS洗涤，800g/min离心lOmin，重复洗涤一次，用冻存液(90%FBS+10%DMS0)冻存细胞，液氮储存。
[0021 ] ELISA实验:复苏HLA-DRB1*09:01基因型患者?8抓，在37°〇，5% CO2孵箱中静置过夜。用去死细胞磁珠去除PBMC中的死细胞。细胞计数，完全培养基重悬细胞至1.25 XlOfMVmL，将200yL/孔细胞悬液铺入9