一种以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及血液制品制药领域，特别是涉及一种以人血浆Cohn组分III为原料的 FEIBA(Factor Eight inhibitor bypassing activity)的制备方法。所述制备方法以人血 浆Cohn法乙醇级分组分III为原料，制备获得了抗凝血因子抑制物的药物FEIBA。
【背景技术】
[0002] 凝血因子的缺乏是导致血友病人止血障碍的根本原因。机体内源性凝血途径启动 之后，活化的凝血因子九(FIXa)与其辅助因子凝血因子八(FVIII)结合，使得FIXa催化凝血 因子十（FX)的活性增强了约100,000~1000,000倍，这是凝血系统产生大量的凝血酶 (Flla)从而迅速达到了止血的目的关键步骤之一。血友病人由于遗传缺陷，其体内的凝血 因子往往活性不足或者缺失。对于A型血友病人，其缺乏的是FVIII，而B型血友病人则是FIX 缺乏。无论是FVIII缺乏还是FIX缺乏，都将使得凝血系统的链式反应受到阻断而造成止血 障碍，病人因此受到失血的危险。
[0003] 通过药物替代疗法，即向病人体内输入所缺乏的凝血因子治疗血友病，已经取得 了较为满意的疗效。目前，因凝血因子一般被制备成浓缩制剂，对血友病的治疗显得尤其方 便和高效。但是，长期以来，对血友病人的治疗仍然面临着另外一个严重的问题，具体来说， 病人体内会产生抑制凝血因子活性的抗体，即"抑制物"的产生。约有15%~25%的病人，在 药物治疗的过程中，其体内会产生这种抗体。并且随着病情的发展，用药剂量的上升，抑制 物的滴度也随之大幅提高。抑制物的产生降低或中和了药物替代疗法的效果，是血友病治 疗过程中无法回避的严重问题。
[0004] 长期以来，基本没有可靠有效的医疗手段能够针对性地治疗产生抑制物的病人， 直到上个世纪70年代，人们发现，以人血浆制备的凝血酶原复合物能够比较有效地治疗产 生抑制物的病人。通过深入研究，Baxter公司首先开发出部分活化的凝血酶原复合物的药 物："Autoplex"和"FEIBA"。这两种药物的上市，使得产生抑制物的血友病人第一次有了可 靠的治疗手段。其后，在上世纪80年代，在对FEIBA药物作用机理的研究基础上，Novo Nordisk A/S又推出了药物〃NovoSeven〃，即活化的凝血因子VII，用以治疗产生FVIII或FIX 抑制物，或者其他出血紊乱的症状。
[0005] 对于FEIBA(Factor Eight inhibitor bypassing activity)的产生和治疗机理， 研究者进行了深入研究并取得了很大进展，但至今还没有最终的结论。一般认为FEIBA具有 矫正凝血系统的作用，即FEIBA具有在FVIII或FIX缺乏的情况下，矫正凝血系统，使之发挥 正常的凝血功能。此外，研究者对FEIBA的各种生成工艺方法也进行了大量研究并有报道。 US PATENT4260025报道，以新鲜血浆或冷沉淀上清为原料，在无钙离子的条件下，加入硅胶 或高岭土等无机物混合并经过低温透析过程后可制得FEIBA。通过离子交换的方式，FEIBA 和其他维生素 K依赖蛋白一起被富集回收。专利还对FEIBA的计量单位进行了规定，一个单 位的FEIBA:能够缩短高滴度FVIII抑制物血浆的APTT至空白值的一半的FEIBA的量。根据其 研究结果，作者认为FEIBA可能是一种不同于凝血因子11，￥11^^，乂的物质，分子量在101? 大小。另外一篇专利US 4364861发现，将组分I上清与阴离子树脂混合，在一定的条件下洗 涤洗脱后，添加或者不添加钙离子进行孵育，也能够大量产生FEIBA，并且不产生过量的凝 血酶。作者还认为FEIBA可能是几种凝血因子的复合物。专利US 4459288则以血浆组分VI-1 为原料，以磷酸钙吸附后洗脱，然后以硅胶进行活化，最后以PEG进行沉淀富集得到FEIBA制 品，其凝血酶的含量小于〇.〇〇3unit/ml，同时还添加了不高于1.5units/ml肝素。大量的研 究工作显示，FEIBA与凝血酶原复合物中的II，VII，FIX，X等凝血因子密切相关，很可能是多 种凝血因子的活化或酶原的复合物，其矫正凝血系统的功能尚待人们进一步的研究阐明。
[0006] 虽然有研究者声称，富含维生素 K依赖蛋白的Cohn组分Ι+ΙΙ+ΙΙΙ，Ι，ΙΙ ΙΙΙ,ΙΙΙ-0，IV-1和IV-4等均有可能作为制备FEIBA的原料，但目前仅有组分I上清和IV-1为原料成功 制备出FEIBA的报道。
【发明内容】
[0007] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种以人血浆Cohn组分 III为原料的FEIBA的制备方法，用于解决现有技术中的问题。
[0008] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种以人血浆Cohn组分III为原料 的FEIBA的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 1)组分III的溶解:将人血浆Cohn组分III加入柠檬酸钠和氯化钠的水溶液中，搅 拌溶解并调节pH至7.0~7.5;
[0010] 具体的，所述人血浆Cohn组分III的制备方法可参照J A M Chem Soc，1946;68: 459,J A M Chem Soc, 1949；71:541 〇
[0011] 在本发明一实施例中，所述人血浆Cohn组分III为血浆Cohn6+9改良法制备获得的 人血浆Cohn组分III。
[0012] 所述人血浆Cohn组分III，更具体为血浆Cohn6+9改良法制备获得的人血浆Cohn组 分III的制备方法具体可参照J A M Chem Soc，1946;68:459，J A M Chem Soc，1949;71: 541 〇
[0013] 所述柠檬酸钠和氯化钠的水溶液具体指该水溶液中同时包括柠檬酸钠和氯化钠 两种溶质。
[0014] 优选的，所述步骤1中，人血浆Cohn组分III与柠檬酸钠和氯化钠的水溶液的重量 比为1:4~5。
[0015]优选的，所述步骤1中，梓檬酸钠和氯化钠的水溶液中，梓檬酸钠的浓度为〇.〇1~ 0 · 02mol/L，氯化钠的浓度为0 · 05~0 · 15mol/L〇
[0016] 优选的，所述步骤1中，调节pH时使用NaHC03水溶液和/或NaOH水溶液和/或HC1水 溶液进行调节。
[0017] 所述步骤1中，本领域技术人员可根据实际情况选择合适种类和浓度的溶剂对溶 液的pH值进行调节，在本发明一实施例中，使用NaHC0 3水溶液、NaOH水溶液、HC1水溶液等进 行pH值的调节。
[0018] 优选的，所述步骤1中，在2~26°C下将人血浆Cohn组分III加入柠檬酸钠和氯化钠 的水溶液中。
[0019] 2)加入沉淀剂并离心：向步骤1所得混合液中加入沉淀剂，至终浓度为4.8~ 5.2的％，在1~4°〇下搅拌20~40分钟，再在1~4°〇条件下将悬浮液进行离心，分离出上清 液；
[0020] 所述沉淀剂能够促进蛋白分子聚集。
[0021] 优选的，所述步骤2中，沉淀剂选自PEG4000、PEG2000、PEG3350等中的一种或多种 的组合。
[0022] 更优选的，所述步骤2中，沉淀剂为PEG4000的水溶液。
[0023]所述步骤2中，本领域技术人员可根据实际情况调整PEG4000水溶液的浓度，在本 发明一实施例中，所述PEG4000水溶液的浓度为39-41Wt%。
[0024] 3)病毒灭活:将步骤2所得上清液澄清处理后进行病毒灭活；
[0025]优选的，所述步骤3中，所述澄清处理具体为经过滤膜过滤。
[0026]优选的，所述步骤3中，病毒灭活的具体方法为S/D法病毒灭活。
[0027]本领域技术人员可选择合适孔径的滤膜对病毒灭活前的处理液进行澄清处理，在 本发明一实施例中，上清液经过〇 · 45um~0 · 22um滤膜过滤，以对S/D病毒灭活前的处理液进 行澄清处理。
[0028] 本领域技术人员可选择适当的S/D法病毒灭活条件进行灭活，在本发明一实施例 中，所述S/D法病毒灭活的条件为：TNBPO. 3wt % +Tween-801wt %，室温，5-6小时。上述条件 具体指在反应体系中添加 TNBP和Tween 80至终浓度分别为0.3 %和1 %，并在室温，保温5-6 小时进行SD病毒灭活。
[0029] 4)凝胶吸附:在步骤3所得混合液中加入凝胶，充分搅拌后过滤收集凝胶；
[0030] 优选的，所述步骤4中，所述凝胶为阴离子交换凝胶，具体为带阴离子基团的凝胶 介质。
[0031 ] 更优选的，所述步骤4中，所述凝胶选自DEAE Sephadex A50凝胶、DEAE Sepharose FF凝胶、Q Sepharose FF凝胶、Q Sepharose XL凝胶、Capto DEAE凝胶、Capto Q凝胶、 Eshmuiio?Q凝胶、Fractogel?EMD TMAE凝胶、Fractogel?EMD DEAE凝胶等中的一种或多种的 组合，进一步优选为预洗后的凝胶，本领域技术人员可根据凝胶的种类确定凝胶的预洗方 法，一般在凝胶产品说明书中均记载有推荐的凝胶预洗方法。
[0032]所述步骤4中，本领域技术人员可根据经验确定凝胶的加入量和加入凝胶以后的 搅拌时间，在本发明一实施例中，优选的凝胶加入量为〇. 5~1.5g/L，搅拌时间为0.5~1.0 小时。
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