蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSerpin蛋白及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在蝶蛹金小蜂 毒液中表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PpSerpin及其编码的核酸序列和应用。
【背景技术】
[0002] 害虫一直严重威胁着全球农作物的安全生产，每年都造成全球粮食产量约1/4的 减产，经济损失巨大。在我国，农业害虫也是一直制约农业增产和农产品质量提高的重要制 约因素，据统计2014年全国病虫害发生面积年约55亿亩/次。每年通过防治病虫害挽回的粮 食损失约占总产的15%~20%，即便如此，每年害虫造成的粮食损失仍可达300亿~500亿 斤。
[0003] 自化学农药DDT问世以来，害虫的防治一直主要依赖化学农药，其后果是出现了害 虫再猖獗、害虫产生抗药性、农药中毒、农药残留超标、污染严重等问题。人们一直探索寻找 新的有效、安全、低毒的害虫防治方法，随着转基因技术的出现，又提供了一种新思路去解 决害虫问题。自20世纪90年代中期以来，抗虫转基因作物培育与应用取得成功，使害虫的有 效控制出现了新机。据统计，全球转基因种植面积由1996年的约170万公顷猛增到2014年的 1.8亿公顷（其中抗虫的占43 % )，其中也产生了明显的经济与生态效应。
[0004] 但是，随着仅有单一 Bt基因抗虫Bt作物的连续种植，靶标害虫对其产生抗性的问 题也随之日趋备受关注，且这种担忧已在Bt棉田的美洲棉铃虫Helicopera zea上已出现迹 象。为此，不少学者一方面又再去寻找发现新的Bt抗虫基因，另外还从微生物、植物和动物 (主要是蝎子、蜘蛛）中挖掘具有杀虫活性的蛋白/肽基因，通过多基因或融合基因等手段， 培育新型抗虫转基因植物，延缓或攻克害虫产生抗性问题。寄生蜂作为一类重要的害虫天 敌，在传统生防中已得到充分肯定，在减少化学农药使用和环境污染方面有着重要作用。寄 生蜂能利用自身携带的多种寄生因子(毒液(venom)、多分DNA病毒(polydnavirusJDV)、类 病毒颗粒（virus like particle，VLP)、类病毒纤丝（virus like filament，VLF)、卵巢蛋 白（ovarian protein，0P)、畸形细胞（teratocyte))，以破坏寄主免疫反应、调节寄主生长 发育、调控寄主血淋巴营养成分以及扰乱寄主生殖和内分泌系统等以保证其后代在寄主血 腔或体表正常发育。若能将寄生蜂的寄生因子结合现代生物技术，可望用于研制新型生防 制剂或转基因作物，将为害虫生物防治开辟新的途径。例如，目前已成功将藏红足侧沟茧蜂 (Microplitis croceipes)畸形细胞的分泌蛋白基因转入烟草，并使烟草天蛾(Manduca sexta)生长明显减缓，危害程度明显低于非转基因对照，使烟草具有抗虫性。Rodriguez-Andres等将毁侧沟苗蜂(Microplitis demolitor)寄生因子]中的Egfl · 0蛋白导转入塞 姆利基森林病毒Semliki Forest virus中，可以显著促进病毒的增值，增强其对埃及伊蚊 Aedes aegypti的致死效果。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种对常见农业害虫具有免疫抑制作用(抑制血 淋巴黑化)的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白基因 PpSerpin及其编码的蛋白质和 用途。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂， 其具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0007] 备注说明：SEQ ID N0:2包含了信号肽，如SEQ ID N0:2中下划线所述。
[0008]作为本发明的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSerpin的改进:该蛋白、其 保守性变异蛋白、其活性片段或其活性衍生物。
[0009]本发明还同时提供了编码上述蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSerpin的 基因，其具有SEQ ID NO: 1中第221-1417位的核苷酸序列；或者与SEQ ID NO: 1中从核苷酸 第221-1417位的核苷酸序列有至少70 %的同源性;或者其核苷酸序列能在40~55°C条件下 与SEQ ID NO: 1中从核苷酸第221-1417位的核苷酸序列杂交。
[0010]作为本发明的基因的改进:序列中包含8~66个连续核苷酸（即SEQ ID NO: 1中第 221-1417位的核苷酸序列中8~66个连续核苷酸）。
[0011 ]本发明还同时提供了上述蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PpSerp in的 用途:用于制备蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，该抑制蛋白能用于抑制菜粉蝶血 淋巴ΡΡ0的激活。
[0012] 本发明还同时提供了上述基因的用途:用于提高十字花科蔬菜对鳞翅目害虫的预 防力，转该基因后的十字花科蔬菜对菜青虫有一定的毒杀作用。
[0013] 本发明还同时提供了一种提高十字花科蔬菜对鳞翅目害虫预防力的方法，包括用 具有SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列的基因转化十字花科蔬菜细胞，再将转化后的十字花 科蔬菜细胞培育成植株。
[0014] 本发明所提供的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白及其编码的核酸序列， 使其能够应用其氨基酸序列、编码序列及其在开发成有应用价值的抗虫作物和生物农药并 应用于农业害虫防治等多个领域。
[0015] 本发明具体是通过以下技术方案实现的:本发明利用蝶蛹金小蜂毒腺转录组测序 获得了毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂基因部分序列，设计引物利用5'_RACE技术获得目的基因 的非编码区，拼接后获得了基因的全长。分离纯化获得蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制 剂PpSerpin的DNA序列后，对其进行了原核表达，并行进了非变性条件下纯化，原核表达的 P p S e r p i η都能够抑制农业害虫菜粉蝶（P i e r i s r a p a e )蛹酸氧化酶前体 (prophenoloxidase，PP0)的激活，阻止其形成有活性的酸氧化酶(phenoloxidase，P0)，具 有抑制寄主体液免疫的功能。
[0016] 本发明所分离出的DNA分子包括:编码具有蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂 PpSerpin的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1中从核苷酸第221-1417位 的核苷酸序列有至少70%的同源性;或者所述的核苷酸序列能在40~55°C条件下与SEQ ID NO: 1中从核苷酸第221-1417位的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的蛋白。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO: 1中从核苷酸第221-1417位的核苷酸序列。
[0017] 本发明分离出的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PpSerpin包括：具有 SEQ ID N0:2氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白、或其活性片段，或者其活性衍生物。 较佳地，该蛋白是具有SEQ ID NO :2序列的蛋白。
[0018] 本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8-66个连续核苷酸。
[0019] 本发明DNA分子转化的宿主细胞是原核细胞。
[0020] 在本发明中，"分离的"、"纯化的"DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两 侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经 与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
[0021] 在本发明中，蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSerpin编码的核酸序列指： 编码具有蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSerpin活性的蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO: 1中第221-1417位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO: 1序 列编码框第221-1417位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取 代后产生的序列。由于密码的简并性，所以与SEQ ID N0:1中第221-1417位核苷酸序列同源 性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0:1所述的序列。
[0022]还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID N0:1中从核苷 酸第221-1417位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO: 1中从核苷酸第 221-1417位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至 少95%的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白 PpSerpin相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包 括(但并不限于）：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核 苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个 以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内）核苷酸。
[0023] 在本发明中蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSerpin或蛋白指:具有蝶蛹金 小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSerpin活性的SEQ ID N0:2序列的蛋白。该术语还包括具 有与天然蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSerpin相同功能的SEQ ID N0:2序列的变 异形式。这些变异形式包括(但并不限于）：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个 (通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性 能相近或相似的氨基