结合肌肉生长抑制素的抗体、组合物和方法
【专利说明】结合肌肉生长抑制素的抗体、组合物和方法
[0001 ]本申请是申请日为2011年08月15日和发明名称为"结合肌肉生长抑制素的抗体、 组合物和方法"的201180044739.7号发明专利申请的分案申请。
[0002] 与相关申请的交叉引用
[0003] 本申请基于35 U.S.C.§119要求提交于2010年8月16日的美国临时申请序列号61/ 374，095的权益，该申请通过引用并入本文。 发明领域
[0004] 本申请一般而言涉及肌肉生长抑制素及与其结合的蛋白质。特别地，本发明涉及 肌肉生长抑制素抑制剂及其用途。
[0005] 发明背景
[0006] 也被称为肌肉生长抑制素的生长/分化因子8(⑶F-8)是TGF-β家族成员，其大部分 在发育中的和成人骨骼肌组织的细胞中表达。肌肉生长抑制素看起来在对骨骼肌生长的负 控制中发挥关键作用(McPherron等，Nature (London) 387，83-90( 1997))。肌肉生长抑制素 基因中的突变已被展示于多个物种中，包括牛、猪、狗和人，并且已导致产生增加的肌肉组 织（Kocamis和Killefer,Domestic Animal Endocrinology 23:447;2002)。此外，已显不， 诘抗肌肉生长抑制素能在动物中增加瘦肌肉的质量(McFerron等，见上文；Zimmers等， Science 296:1486(2002))〇
[0007]已在人临床试验中评估了肌肉生长抑制素拮抗剂。在具有多种形式的肌营养不良 症的患者中评估了被称为MY0-29的人抗体。使用该肌肉生长抑制素拮抗剂的早期临床结果 展示出良好的安全性和耐受性，而在肌肉强度或功能方面没有显著的改善(但该研究没有 被推动以展示疗效）；在有限数量的受试者中注意到趋向于肌肉尺寸增加的趋势(Wagner 等，Ann. Neuro 1.63: 561; 2008)。在随后的报道中，经治疗的患者中总的定量肌肉强度测量 没有改善，但是若干患者显示出单根肌纤维收缩特性的改善（Krivickas等，Muscle Nerv.39:3;2009)〇
[0008] 人们相信，对肌肉生长抑制素途径的调控需要将潜在肌肉生长抑制素复合体加工 为成熟肌肉生长抑制素。潜在复合体是切割的前肽结构域形成的，其与成熟C-末端二聚体 非共价连结并且没有生物活性。认为组织特异性因子负责将无活性复合体转化为生物活性 形式。肌肉生长抑制素还与卵泡抑素相关基因（FLRG)和生长及分化相关的因子相关的血清 蛋白-1 (GASP-1)形成复合体，这两种复合体均已在血清中被鉴定。
[0009] 成熟的肌肉生长抑制素以高亲和性与活性IIB型受体(ActRIIB)结合，并以较低的 亲和性与激活素(activin)受体(ActRIIA)结合。细胞内信号传递通过二聚肌肉生长抑制素 与ActRIIB的结合接着募集低亲和性I型受体（激活素样激酶4(ALK4)或激活素样激酶5 (ALK5))而启动。I型受体的磷酸化导致负责肌肉生长抑制素生物作用的细胞内信号传递途 径的启动。
[0010] 肌肉生长抑制素拮抗剂的体内利用已不仅被牵连于肌肉生长抑制素途径的调控 和信号传递本质，还被牵连于肌肉生长抑制素与生长和分化因子11(GDF-11;也被称为骨形 态形成蛋白11或BMP-11)的高度相似性，该因子在活性结构域中在氨基酸水平上与肌肉生 长抑制素90%相同。虽然在信号传递机制中的高度序列同一性和相似性暗示肌肉生长抑制 素和GDF-11共享某些功能，但对这两种TGF-β家族成员的靶向基因破坏却显示非常不同的 结果。肌肉生长抑制素敲除小鼠显示肌纤维的增生和肥大，而GDF-11敲除小鼠则在出生后 很快死亡并且具有大量的异常；双敲除动物显示在单敲除小鼠中未观察到的额外异常 (McPherron等，BMC Dev Biol .9:24;2009)〇
[0011] 因此，本领域中仍需要结合肌肉生长抑制素并且拮抗其活性、同时消除或最小化 抑制其和相关途径的不利作用的试剂。
[0012] 附图简述
[0013] 图1描述了给予肌肉生长抑制素抑制剂(抗肌肉生长抑制素抗体12A5-5,实心菱 形）的小鼠与对照(PBS;空心圆）相比的总体重，如实施例4所示。
[0014]图2展示了通过核磁共振(NMR)测定的第4周的瘦体质量的改变。
[0015] 图3展示了具有指定的分子内和分子间二硫键的成熟形式的人肌肉生长抑制素的 氨基酸序列。二硫键 〇7815-〇7874、〇7843-〇78106和〇7847_〇78108形成胱氨酸结(1〇1〇1:)结 构。
[0016] 图4描述了肽G-级结构，其显示二硫键将四个LycC肽连接到一起形成胱氨酸结， 另一个二硫键将两个55-78序列在Cys73连接到一起。肽G显示与抗体结合。
[0017] 图5展示了肽N-级结构，其显示二硫键将四个糜蛋白酶肽连接到一起形成胱氨酸 结，另一个二硫键将两个63-82序列在Cys73连接到一起。肽N不结合抗体。
[0018] 图6代表了针对非还原和tcep还原肽样品的BIAcore?竞争检验的结果。肽A、c、 E、G、0和P全部能结合抗体12A5-5由此防止12A5-5结合成熟肌肉生长抑制素。测试的其他肽 (包括来自肽G和肽N的TCEP还原的那些，胱氨酸结糜蛋白酶肽)均不显示与抗体结合。、
[0019] 图7描述了针对肽A、C、E和G以及肌肉生长抑制素的直接BIAcore?结合检验的 结果。
[0020] 图8代表了源于肌肉生长抑制素/卵泡抑素复合体的共结晶结构的肌肉生长抑制 素二聚体和单体的结构(Cash等，见下文）。示出了参与二硫键的Cys残基，以及被认为对于 12A5-5的结合来说重要的区域中的另外的氨基酸残基（以阴影长菱形示出）。
【发明内容】
[0021] 本发明提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其以小于ΙΟΟρΜ的Kd结合 肌肉生长抑制素。在一种实施方式中，本发明提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗 体，其以小于1〇〇ρΜ的Kd结合肌肉生长抑制素并且以高于10nM的Kd结合GDF-11。在另一实施 方式中，本发明提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其以是其对GDF-11的亲和 性至少5000倍高的亲和性结合肌肉生长抑制素。在又一实施方式中，本发明提供了一种分 离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其展示出针对肌肉生长抑制素的选择性，该选择性是针 对GDF-11的至少5000倍高。
[0022] 在本发明的一个方面，提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其结合肌 肉生长抑制素并且阻碍肌肉生长抑制素与ALK4的相互作用。在另一方面，提供了一种分离 的肌肉生长抑制素特异性抗体，其结合肌肉生长抑制素并阻碍肌肉生长抑制素与ALK4的相 互作用但是与肌肉生长抑制素 /ActRIIA复合体和/或肌肉生长抑制素 /ActRIIB复合体共结 合。
[0023] 在本发明的另一方面，提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其结合肌 肉生长抑制素，其中肌肉生长抑制素中对于肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素特异性拮抗 剂的结合所需的两个区域位于成熟肌肉生长抑制素 （SEQ ID N0: 25)的第21至31位和第50 至60位附近的序列。还提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其与肌肉生长抑制 素中位于成熟肌肉生长抑制素的第21至31位和第50至60位附近的序列的两个区域相互作 用，以防止这些区域内肽键的糜蛋白酶切割。
[0024] 在本发明的一种实施方式中，肌肉生长抑制素特异性拮抗剂是包含至少一条轻链 和至少一条重链的抗体，其中轻链包含恒定区和含有三个互补性决定区（CDRs)的可变区， 并且重链包含恒定区和含有三个互补性决定区（CDRs)的可变区。该实施方式可并入本发明 的前述实施方式和/或方面中的一种或多种。在某些实施方式中，重链和轻链CDRs的序列是 如本文中所公开的。在一种实施方式中，轻链⑶Rs是SEQ ID N0:10中公开的那些，并且重链 CDRs是SEQ ID N0:20中公开的那些。在另一实施方式中，轻链CDRs选自SEQ ID NO: 1中公开 的轻链CDRs、SEQIDN0:2中公开的轻链CDRs、SEQIDN0:3中公开的轻链CDRs、SEQIDN0: 4中公开的轻链CDRs、SEQ ID N0:5中公开的轻链CDRs、SEQ ID N0:6中公开的轻链CDRs、SEQ ID NO: 7中公开的轻链CDRs、SEQ ID NO: 8中公开的轻链CDRs和SEQ ID NO: 9中公开的轻链 CDRs构成的组；以及重链CDRs选自SEQ ID NO: 11中公开的重链CDRs、SEQ ID NO: 12中公开 的重链CDRs、SEQIDN0:13中公开的重链CDRs、SEQIDN0:14中公开的重链CDRs、SEQID N0 :15中公开的重链CDRs、SEQIDN0:16中公开的重链CDRs、SEQIDN0:17中公开的重链 CDRs、SEQ ID NO: 18中公开的重链CDRs和SEQ ID NO: 19中公开的重链CDRs构成的组。
[0025] 在某些实施方式中，重链可变区和轻链可变区的序列是如本文所公开的。在一种 实施方式中，轻链可变区包含SEQ ID N0:10中示出的氨基酸序列，重链可变区包含SEQ ID N0:20中示出的氨基酸序列。在另一实施方式中，轻链可变区选自SEQ ID NO: 1中公开的轻 链可变区、SEQ ID NO: 2中公开的轻链可变区、SEQ ID NO: 3中公开的轻链可变区、SEQ ID N0:4中公开的轻链可变区、SEQ ID N0:5中公开的轻链可变区、SEQ ID N0:6中公开的轻链 可变区、SEQ ID N0:7中公开的轻链可变区、SEQ ID N0:8中公开的轻链可变区和SEQ ID N0:9中公开的轻链可变区构成的组，并且重链可变区选自SEQ ID NO: 11中公开的重链可变 区、SEQ ID N0:12中公开的重链可变区、SEQ ID N0:13中公开的重链可变区、SEQ ID N0:14 中公开的重链可变区、SEQ ID NO: 15中公开的重链可变区、SEQ ID NO: 16中公开的重链可 变区、SEQ ID N0:17中公开的重链可变区、SEQ ID N0:18中公开的重链可变区和SEQ ID NO: 19中公开的重链可变区构成的组。
[0026] 还提供了前述抗体的变体。在一种实施方式中，变体抗体与抗体之一（例如抗体 12A5-5)90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 相同。在另一实施方式 中，变体抗体与前述抗体(例如12A5-5)在一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九 个或十个氨基酸残基处不同（通过氨基酸的取代或缺失）。在另一实施方式中，一个(或多 个)氨基酸被翻译后修饰(例如通过环化或转化为另外的氨基酸;和/或通过脱酰胺化、异构 化、糖化和/或氧化）。
[0027 ] 在本发明的又一方面，抗体轻链恒定区选自κ和λ轻链构成的组，并且重链恒定区 选自μ、δ、γ、α和ε重链恒定区构成的组。又一实施方式提供了一种抗体，所述抗体属于选自 IgGl、IgG2、IgG3和IgG4构成的组的亚类。应当理解，本发明的这些方面可同等应用于之前 描述的方面和实施方式。
[0028] 本发明还提供了编码任何前述肌肉生长抑制素特异性拮抗剂的分离的核酸、以及 包含此类核酸的载体、用此类载体转染或转化的分离的宿主细胞和用于生产肌肉生长抑制 素特异性拮抗剂的方法，所述方法包括在促进表达的条件下培养此类宿主细胞以及从培养 基中回收肌肉生长抑制素特异性拮抗剂。还提供了包含前文描述的肌肉生长抑制素特异性 拮抗剂和生理上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂的组合物，以及抑制肌肉生长抑制素的至 少一种活性的方法，所述方法包括将此类组合物施用至个体使得肌肉生长抑制素的至少一 种活性被部分或完全抑制。
[0029] 在本发明的另外一些实施方式中，个体患有选自下述病况构成的组的病况:性功 能减退(包括雄激素剥夺疗法导致的性功能减退，和年龄相关的性腺机能减少导致的性功 能减退），恶病质；心源性恶病质；肾源性恶病质，心脏萎缩；心发育不良；心衰（heat failure);肌肉减少症;外伤性骨折;骨质疏松性骨折;骨损失（例如骨质疏松症或骨质减 少）；阿狄森氏病；肌萎缩性侧索硬化或运动神经元病(ALS ;MND;卢格里格病）；贝尔麻痹 (和/或面部神经问题）；肉毒杆菌中毒;脑性麻痹;进行性神经性腓骨肌萎缩症(〇^^〇卜 Marie-Tooth disease)和其它外周神经病;库欣综合征;糖尿病性神经病;格林-巴利综合 征；多发性硬化;肌萎缩(包括进行性肌萎缩和脊髓性肌萎缩）；肌营养不良症(其有多种形 式;包括Becker型肌营养不良，先天性肌营养不良，Duchenne型肌营养不良，远端型肌营养 不良，Emery-Dreifuss型肌营养不良，面肩肱型肌营养不良症，肢带型肌营养不良症，强直 性肌营养不良症，眼咽型肌营养不良，脊髓性肌萎缩，131'0￥11-'\^3161：1：0-'\^111^6代综合征 (BVVL)、Fazi 〇-L〇nde(FL)综合征和特征在于进行性骨骼肌无力的其它综合征，肌肉蛋白质 中的缺陷，以及肌肉细胞和组织的死亡）；重症肌无力；脊髓灰质炎；多肌炎;肌肉、肌腱和/ 或韧带的扭伤和拉伤；中风(和其他导致肌肉消耗的病况，例如长期不活动或卧床，肢固定 (例如通过打石膏和/或上夹板)和太空飞行）；和可通过生长激素、胰岛素生长因子-UIGF-1)、生长激素促分泌素和与激素-IGF-1轴相关的其他试剂治疗的病况。
[0030] 发明详述
[0031 ]本发明提供了与和肌肉生长抑制素结合(例如抗肌肉生长抑制素抗体、抗体片段 和抗体衍生物)并且至少抑制肌肉生长抑制素的生物活性的分子相关的组合物、试剂盒和 方法。在本文中使用时，术语"肌肉生长抑制素拮抗剂"与"肌肉生长抑制素抑制剂"可互换 使用。根据本发明的肌肉生长抑制素拮抗剂抑制或阻碍肌肉生长抑制素的至少一种活性， 或者，阻碍肌肉生长抑制素或其受体的表达。可实现对肌肉生长抑制素活性的抑制或阻碍， 例如通过利用一种或多种干扰肌肉生长抑制素与其受体的结合和/或阻碍肌肉生长抑制素 与其受体的结合导致的信号传导的抑制性试剂来实现。拮抗剂包括与肌肉生长抑制素自身 结合的试剂，或者与肌肉生长抑制素受体结合的试剂。例如，肌肉生长抑制素拮抗剂包括但 不限于：卵泡抑素、肌肉生长抑制素前结构域(prodomain)、生长和分化因子ll(GDF-ll)前 结构域、前结构域融合蛋白质、与肌肉生长抑制素结合的拮抗性抗体、与激活素 IIB型受体 结合的拮抗性抗体或抗体片段、可溶性激活素 IIB型受体、可溶性激活素 IIB型受体融合蛋 白质、可溶性肌肉生长抑制素类似物(可溶性配体）、寡核苷酸、小分子、肽性模拟物和肌肉 生长抑制素结合试剂。这些在下文中被更详细地描述。
[0032] 本发明还提供了包含编码与肌肉生长抑制素结合的多肽的全部或部分的核苷酸 序列的核酸及其衍生物和片段，例如，编码抗肌肉生长抑制素抗体、抗体片段或抗体衍生物 的全部或部分的核酸;包含此类核酸的质粒和载体，以及包含此类核酸和/或载体和质粒的 细胞或细胞系。提供的方法包括，例如，制造、鉴定或分离与肌肉生长抑制素结合的分子(例 如抗肌肉生长抑制素抗体)的方法，测定分子是否与肌肉生长抑制素结合的方法，制造包含 与肌肉生长抑制素结合的分子组合物例如药物组合物的方法，以及用于将结合肌肉生长抑 制素的分子施用至受试者的方法，例如，用于治疗由肌肉生长抑制素介导的病况或用于体 内或体外拮抗(或抑制)肌肉生长抑制素的生物活性的方法。肌肉生长抑制素的一种此类生 物活性是与肌肉生长抑制素受体的结合;另一种此类活性是对骨骼肌生长的负调控。
[0033] 使用标准的单字母或三字母缩写来示出多核苷酸和多肽序列。除非另有指明，每 条多肽序列具有左边的氨基末端和右边的羧基末端;每条单链核酸序列以及每条双链核酸 序列的第一链(top strand)在左边具有5'末端以及在右边具有3'末端。还可通过解释与参 照序列有何不同来描述特定的多肽或多核苷酸序列。
[0034] 除非另有指明，用于本发明的科学和技术术语将具有与本领域普通技术人员通常 理解相同的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语将包括多数，并且复数术语将包括 单数。通常，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白 质及核酸化学和杂交相关使用的命名法和技术是本领域中公知和常用的那些。
[0035] 除非另有指明，本发明的方法和技术通常是根据本领域中公知的常规方法进行 的，并且如在本申请文件中通篇提到和讨论的多篇一般性和更具体的参考文献所述。见例 如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor ,N·Y·(1989)和Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，和Harlow和 Lane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N.Y. (1990)，其通过引用并入本文。酶反应和纯化技术按照厂商说明、如本 领域通常进行的那样或如本文所述来进行。本文所述的与分析化学、合成有机化学和医药 和制药化学相关使用的术语是本领域公知和常用的那些。可使用标准技术进行化学合成、 化学分析、药物制备、配方和递送以及对患者的治疗。
[0036] 除非另有指明，下述术语应当被理解为具有下述含义。
[0037] 术语"分离的分子"（其中分子例如是多肽、多核苷酸或抗体)是由于其来源或衍生 的来源而（1)不与在其天然状态下伴随其的天然连结的组分连结，（2)基本上不含来自相同 物种的其它分子，（3)通过来自不同物种的分子表达或(4)没有人工干预时在自然界不存在 的分子。因此，化学合成的、或在不同于其天然来源的细胞的细胞体系中合成的分子将是与 其天然连结的组分分离的。还可使用本领域公知的纯化技术通过分离而是分子基本上不含 天然连结的组分。可通过本领域公知的多种手段来检验分子纯度或同质性(homogeneity)。 例如，可使用本领域公知的技术，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳以及对凝胶染色以观察多肽，来 检验多肽样品的纯度。就某些目的而言，可通过使用HPLC或本领域公知用于纯化的其它手 段来提供更高的分辨力。
[0038] 术语"肌肉生长抑制素抑制剂"和"肌肉生长抑制素拮抗剂"可互换使用。每种均为 可检测到抑制肌肉生长抑制素的至少一种功能的分子。相反，"肌肉生长抑制素激动剂"是 可检测到增加肌肉生长抑制素的至少一种功能的分子。肌肉生长抑制素抑制剂导致的抑制 无须是完全的，只要其可检测到即可，例如通过使用检验来检测。可使用对肌肉生长抑制素 功能的任何检验，其例子提供于本文。可被肌肉生长抑制素抑制剂抑制(或可被肌肉生长抑 制素激动剂增加）的肌肉生长抑制素的功能的例子包括与肌肉生长抑制素受体(或表达此 类受体的细胞)的结合，和对骨骼肌生长的负调控。肌肉生长抑制素抑制剂和肌肉生长抑制 素激动剂的类型的例子包括但不限于:肌肉生长抑制素结合多肽，例如抗原结合蛋白质(例 如肌肉生长抑制素抗原结合蛋白质）、抗体、抗体片段和抗体衍生物。
[0039] 术语"肽"、"多肽"和"蛋白质"均表示包含通过肽键互相相连的两个或多个氨基酸 残基的分子。这些数据包括例如天然和人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似 物(例如突变蛋白质、变体和融合蛋白质）以及经翻译后修饰或共