结合蛋 白质的结合。检测抗原结合蛋白质与肌肉生长抑制素的结合可通过可检测地标记抗原结合 蛋白质而简化，如上文所讨论的。在又一实施方式中，肌肉生长抑制素结合分子被进一步分 析，以确定其是否抑制肌肉生长抑制素活化和/或信号传递。
[0128] 本发明还包括药物组合物，其包含有效量的本发明的多肽产品与可用于肌肉生长 抑制素疗法的可药用稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂。此类组合物包括多 种缓冲成分(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐）、pH和离子强度的稀释剂;添加剂，例如去垢剂 和增溶试剂（例如Tween 80,聚山梨醇酯80)，抗氧化剂（例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠），防腐 剂(例如硫柳萊(Thimersol)、苯甲醇)和填充剂(bulking agent)(例如乳糖、甘露糖醇），基 元例如聚合物(例如聚乙二醇或其他基元)与蛋白质的共价连结（如上文所讨论的，还见例 如美国专利4,179,337,其通过引用并入本文）；将材料掺入聚合化合物(例如聚乳酸、聚乙 醇酸等等)的特定制剂或掺入脂质体。此类组合物将影响肌肉生长抑制素的物理状态、稳定 性、体内释放速率以及体内清除率。见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences，18th Ed. (1990，Mack Publishing Co.，Easton,PA 18042)1435-1712页，其通过引用并入本文。
[0129] 通常，本发明的肌肉生长抑制素抑制性多肽的有效量将通过接受者的年龄、体重 和疾病的病况或严重性来确定。见Remingtons Pharmaceutical Sciences，上文，697-773 页，其通过引用并入本文。典型地，可使用大约〇.〇〇lg/kg提供至大约lg/kg体重之间的剂 量，但是医师将认识到可以使用更多或更少。对于局部（即，非全身性)应用而言，例如对于 局部性应用，给剂量可在大约〇.〇〇lg/cm 2至大约lg/cm2之间。给剂量可以一天一次或多次， 或者频次更少，并且可以与本文所述的其他组合物联合。应当注意，本发明不限于本文提到 的剂量。
[0130] 本发明提供了药物组合物和治疗多种病症的方法，其中使用肌肉生长抑制素拮抗 剂，包括肌肉生长抑制素结合试剂(或肌肉生长抑制素结合多肽，包括抗体）。本发明提供了 在需要其的受试者中治疗性功能减退的作用的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效 量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合 物施用。在一种实施方式中，性功能减退是雄激素剥夺疗法导致的。在第二实施方式中，性 功能减退是年龄相关的性腺机能减少导致的。
[0131] 本发明还提供了在受试者中治疗恶病质的方法，所述受试者正遭受此类病况，所 述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑 制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。所述病况可以是原发恶病质或继发恶病质。在 一种实施方式中，受试者患有风湿病恶病质或作为自身免疫病况或炎性病况(包括慢性阻 塞性肺病或coro)的并发症或结果而发生的恶病质。本发明还提供了在需要其的受试者中 治疗由于烧伤导致的恶病质的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌 肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。本发明 还提供了在遭受特征在于过量TNF-α的炎性病况的受试者中降低肿瘤坏死因子(TNF)-a的 方法。
[0132] 本发明还提供了对需要下述治疗的受试者治疗由于用化学试剂(例如化疗剂)治 疗导致的恶病质的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制 素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。本发明还提供了当 恶病质是由于癌症或肿瘤病况导致时、由针对癌症或肿瘤病况的任何治疗导致时或是所述 病况和所述治疗的组合作用时，在患有癌症或肿瘤病况的个体中治疗恶病质的方法。
[0133] 本发明还提供了在需要下述治疗的受试者中治疗由于糖尿病导致的恶病质的方 法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉 生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。本发明还提供了在遭受糖尿病性神经病 的患者中治疗糖尿病性神经病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种 肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。
[0134] 本发明还提供了治疗心源性恶病质和/或肾源性恶病质的方法，所述方法包括向 受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与 可药用载剂作为混合物施用。恶病质是慢性心衰(CHF)的常见并发症，其与炎性细胞因子例 如TNF-α的增加的血浆水平和分解代谢/合成代谢途径的不平衡相关联。患有慢性肾衰 (CRF)和/或终末期肾病(ESRD)的受试者通常也患有到恶病质，这也可归因于促炎性试剂的 升高的水平。
[0135] 本文还提供了治疗心脏萎缩和/或心脏发育不良的方法。心脏萎缩在患有癌症的 个体中发生，也在长期卧床或在导致随意肌(voluntary muscle)萎缩的其他状况或病况的 个体中发生。此外，本发明的选择性肌肉生长抑制素拮抗剂还可用于治疗其中心肌效率降 低的其他病况，例如，心衰(例如，充血性心衰）。本发明还可用于治疗在饮食病症或饥饿中 发生的心脏异常。
[0136] 本发明还提供了治疗以前通过生长激素、胰岛素生长因子-l(IGF-l)、生长激素促 分泌素和与生长激素-IGF-1轴相关的其他试剂来治疗的疾病或病况的备选方法。肌肉生长 抑制素拮抗剂提供了治疗此类病症并且没有这些试剂的潜在危险副作用的方法。肌肉生长 抑制素拮抗剂还提供了治疗生长激素抗性(被认识到的衰老中的疾病）的方法。在一种实施 方式中，本发明提供了治疗Prader-Willi综合征的作用的方法，所述方法在遭受此类病况 的受试者中进行，包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述 肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。
[0137] 本发明还提供了治疗肌肉减少症(包括老年人的肌肉减少症）以及其他肌肉疾病 或病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗 剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。本发明还提供了治疗老年 人的虚弱的方法，包括用于复健疗法，以及与力量和/或平衡训练联合，以及用于降低或预 防跌倒。
[0138] 本发明还提供了协助外伤性骨折的治愈和骨质疏松性骨折的修复以及对一般性 的骨损失（例如骨质疏松症和/或骨质减少)或伴随长期不运动或卧床和/或肢固定的结果 的骨损失的治疗的方法。
[0139] 针对病况施用肌肉生长抑制素拮抗剂能证明有益的其他病况包括阿狄森氏病;肌 萎缩性侧索硬化或运动神经元病(ALS;MND;卢格里格病）；贝尔麻痹(和/或面部神经问题）； 肉毒杆菌中毒;脑性麻痹;进行性神经性腓骨肌萎缩症和其它外周神经病;库欣综合征;糖 尿病性神经病;格林-巴利综合征；多发性硬化;肌萎缩(包括进行性肌萎缩和脊髓性肌萎 缩）；肌营养不良症(其有多种形式;包括强直性肌营养不良症）；重症肌无力;脊髓灰质炎； 多肌炎;肌肉、肌腱和/或韧带的扭伤和拉伤；中风(和其他导致肌肉消耗的病况，例如长期 不活动或卧床，肢固定(例如通过打石膏和/或上夹板)和太空飞行）。
[0140] 本发明的肌肉生长抑制素结合蛋白质还可用于诊断方法。例如，可通过与可检测 标志物物质的连结来"标记"本发明的抗原结合蛋白质（例如用1251进行放射性标记或与另 外的可检测基元缀合），以提供可用于在固体组织和液体(例如血液或尿液)样品中检测和 定量肌肉生长抑制素的试剂。本发明还包括含有此类经标记的材料的试剂盒。
[0141] 下述实施例是阐述本发明的特定实施方式或特定的目的而提供的，其并不限制本 发明的范围。
[0142] 实施例1抗肌肉生长抑制素抗体
[0143] 制备了若干变体抗肌肉生长抑制素抗体，针对活性进行了测试;它们的序列如下 表1和2所示。
[0144] 表1:抗肌肉生长抑制素抗体重链序列
[0145]
[0148] 表2:抗肌肉生长抑制素抗体轻链序列
[0149]
[0152] 实施例2体外检验
[0153] 在若干检验中评估了抗肌肉生长抑制素抗体的活性。
[0154] 基于C2C12细胞的肌肉生长抑制素活性检验
[0155] 本检验通过测量肌肉生长抑制素与其受体的结合被抑制的程度证实了被测试的 抑制剂的肌肉生长抑制素中和能力。
[0156] 通过用pMARE-luc构建体转染C2C12成肌细胞(ATCC No:CRL-1772)来产生肌肉生 长抑制素应答报道细胞系。pMARE-luc构建体是通过下述方式制造的:将代表肌肉生长抑制 素/活化素应答元件的CAGA序列的12个重复（Dennler et al.EMBO 17:3091-3100(1998)) 在TATA盒上游克隆进报道载体(Stratagene cat#219087)。成肌细胞C2C12细胞天然在细胞 表面表达肌肉生长抑制素/活化素报道子。当肌肉生长抑制素结合细胞受体时，Smad途径被 活化，磷酸化的Smad结合应答元件(Macias-Silva et al.Cell 87:1215(1996))，导致焚光 素酶基因的表达。然后使用商业荧光素酶报道子检验试剂盒（cat#E4550，Pr 〇mega， Madison，WI)按照厂商方案测量荧光素酶活性。已经用pMARE-luc(C2C12/pMARE克隆#44)转 染的C2C12细胞的稳定系被用于根据下述流程测量肌肉生长抑制素活性。
[0157] 将相等数量的报道子细胞(C2C12/pMARE克隆#44)涂布进96孔培养物。在室温下将 成熟的肌肉生长抑制素与待测试的抗体一起预孵育1小时。在有或没有抗体的情况下，用肌 肉生长抑制素处理报道子细胞培养物六小时。通过测定被处理的培养物中的荧光素酶活性 来测量肌肉生长抑制素活性。该检验可用于最初鉴定出抑制肌肉生长抑制素信号活性的抗 体;可使用具有固定浓度的肌肉生长抑制素的不同浓度的抗体来产生滴定曲线。此类滴定 曲线被用于针对大量抗体测定IC 5Q，如下表3所示。
[0158] 表3:多种抗肌肉生长抑制素抗体变体的IC5〇
[0159]
[0160]单克隆抗体12A5-5被选用于进行进一步的分析。
[0161] K inExA?溶液平衡检验中肌肉生长抑制素的结合
[0162] 使用KinExA?技术的基于溶液的平衡结合检验（Sapidyne Instruments， Inc.)被用于测定肌肉生长抑制素与抗体分子的结合的解离平衡(Kd)。该基于溶液的检验 被认为在某些情况下比BIAcore?检验更为灵敏。用50微G/rnl肌肉生长抑制素预涂布 1^&(：1:;[-6616乂(高度反应性的、交联的6%琼脂糖珠粒，用于固定含有酰胺的配体 ;1'1161'1]1〇 Scientific Pierce，Rockford，IL) 一夜，然后用牛血清清蛋白（BSA; lmg/ml)进行封闭。将 抗体样品（1〇ρΜ和30pM)与多种浓度(0.5pM至5nM)的肌肉生长抑制素在含有0. lmg .ml BSA 的样品缓冲液中于室温下孵育8小时，之后在涂布肌肉生长抑制素的珠粒上运行(run)。通 过在Sup erB 1〇 ck? (优化的基于蛋白质的溶液，用于封闭过量结合位点；T h e r m 0 Scientific Pierce，Rockford，IL)中lmg/ml的焚光(Cy5)标记的山羊抗人Fc抗体对珠粒结 合的抗体的量进行定量。结合信号与给定肌肉生长抑制素浓度时的平衡下游离抗体的浓度 成比例。使用KinExA?软件(Sapi dyne Instruments，Inc.)中提供的双曲线单位点同源结合 模型，从竞争曲线的非线性回归获得Kd。抗体12A5-5在该检验中显示出大约2pM的Kd。
[0163] 使用Biacore?的选择性检验
[0164] 使用Biac〇re?(基于无标记表面等离子共振(SPR)的技术，用于实时研究生物分子 相互作用）（GE Healthcare，Chalfont St .Giles，UK)针对12A5-5进行结合特异性分析。 12A5-5和ActRIIB/Fc 自行制造，，TGFbetaRII/Fc和BMPR-IA/Fc来自 R&D Systems (Minneapolis，MN)。按照厂商建议的方案，将Mab 12A5-5和受体共价偶联至研究级的传感 器芯片。将每种配体10纳摩尔流经被固定的高密度抗体和受体表面。肌肉生长抑制素、 GDF11、GDF3、激活素 A、激活素 AB、激活素 AC、TGF-βΙ、BMP4、BMP9和BMP 10对它们的相应受体 的结合被测试，并被用作为对配体结合至12A5-5和其他受体的信号进行标准化的对照。数 据清楚显示，Mab 12A5-5不结合⑶F3、激活素 A、激活素 AB、激活素 AC、TGF-m、BMP4、BMP9S BMP10。在单独的实验中，抗体12A5-5显示出以估计为180nM的亲和性(Kd)与⑶F11的弱结 合。结果表明，抗体12A5-5对肌肉生长抑制素是特异性的，并且其展示出较之针对GDF11而 言针对肌肉生长抑制素的1 〇〇〇〇倍的选择性。
[0165] 实施例3另外的体外检验
[0166] 基于细胞的检验，以比较对肌肉生长抑制素的抑制和对GDF-11的抑制
[0167] 基本按照与之前所述进行基于细胞的检验，比较对肌肉生长抑制素的结合的抑制 与对GDF-11的结合的抑制的I C5〇。结果如下表4所示。
[0168] 表4对肌肉生长抑制素或GDF-11活性的抑制
[0169]
[0170] 这些结果表明，12A5-5在该检验中抑制了肌肉生长抑制素的活性，如对照多肽那 样(描述于美国专利7,511，012中），但是，对照肽还抑制⑶F-l 1的活性，而抗体12A5-5则不。
[0171] 在ALK4、ActRIIA和ActRIIB/Fc表面上的结合检验
[0172] 基本按照与之前针对肌肉生长抑制素所述，使用具有固定的ALK4/Fc、ACtRIIA/Fc 和ActRIIB/Fc(R&D Systems Minneapolis，MN)表面的Biacore?系统，进行肌肉生长抑制素 结合检验。在存在或不存在溶液中的抗体时，测量肌肉生长抑制素与被固定的受体的结合 信号，并将其与不存在抗体时肌肉生长抑制素的结合信号（其被设定为100% (对照））相比 较。减少的结合应答表示抗体与肌肉生长抑制素的结合阻碍了肌肉生长抑制素与受体亚单 位的结合，而增加的结合应答表明抗体与肌肉生长抑制素/受体复合体共结合。结果显示于 下表5中。
[0173] 表5:12A5-5对于肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素受体亚单位的结合的影响
[0174]
[0175] 这些结果表明，12A5-5和对照多肽（之前描述的）阻碍了肌肉生长抑制素/ALK4相 互作用，但是与肌肉生长抑制素/ActRIIB和肌肉生长抑制素/ActRIIA共结合。
[0176] 在K i ηΕχΑτ'·§液平衡检验中与原肌肉生长抑制素 (promyo statin)的结合
[0177] 进行与之前所述相似的KinExA?检验，但其中使用原肌肉生长抑制素代替天然肌 肉生长抑制素。用大约50微G/ml的原肌肉生长抑制素预涂布Reacti-Gel 6X-夜，然后用 BSA封闭。将10pM的抗体样品与多种浓度(0.5pM至5nM)的原肌肉生长抑制素在样品缓冲液 中于室温下孵育8小时，之后在原肌肉生长抑制素涂布的珠粒上运行。基本按照之前所述来 对珠粒结合的抗体加以定量。按照描述从非线性回归获得Kd;抗体12A5-5以~2pM的K d结合 原肌肉生长抑制素。
[0178] 实施例4抗体的体内合成代谢活性
[0179] 使用C57BL6小鼠模型（Charles River Laboratories Massachusetts)来测定本 发明的肌肉生长抑制素抑制剂的体内效力。该模型以快速合成代谢应答应答于本发明的抑 制剂，其与增加的干肌肉质量和肌纤维蛋白质的增加相关，但是与身体水含量的积累无关。
[0180] 在一个实例中，通过下述实验证实了 12A5-5的体内效力。用10mg/kg的剂量(皮下 注射)对八只8周龄的C57BL6小鼠的组进行每周一次的处理。八只8周龄的C57BL6小鼠的对 照组获得每周的介载体(PBS)(皮下)注射。每周对动物称重，并在第0周和第4周测定瘦肉机 体质量。结果示于图1和图2。图1显示了较之对照而言抗体施用4周期间小鼠的总体重增加。 在图中，抗肌肉生长抑制素抗体12A5-5用实心菱形代表，对照用空心圆代表;针对多个数据 点的P值如下所示：* = P〈〇 · 05 ;** = P〈0 · 01;和*林= p〈0 · 001。图2显示了通过核磁共振 (NMR)成像(EchoMRI 2003，Echo Medical Systems,Houston,TX)测定的第4周瘦肉机体质 量的改变;P值如前文所述。
[0181] 因此，肌肉生长抑制素拮抗剂12A5-5在小鼠中导致增加的体重和增加的瘦肌肉质 量;在猕猴研究中也证实了类似的结果。
[0182] 实施例5针对抗肌肉生长抑制素中和单克隆抗体12A5-5鉴定表位
[0183] 人肌肉生长抑制素的成熟形式是109个氨基酸的蛋白质，在分子中具有9个半胱氨 酸，其形成了分子内和分子间二硫键（如图3所示）。八元环结构是经由Cys43-Cysl06和 Cys47_Cysl08二硫键合形成的。Cysl5_Cys74二硫键穿透其他二硫键形成的环结构，并且制 造了胱氨酸结结构。Cys6和Cysl6在N-末端区形成二硫键，其并非胱氨酸-结的一部分。第一 肌肉生长抑制素单体的Cys73和第二肌肉生长抑制素单体的Cys73之间的分子间二硫键形 成以使得天然肌肉生长抑制素成为共价连接的二聚体。两个肌肉生长抑制素单体在天然状 态下作为反平行结构三维折叠 (Cash et al.，EMBO J(2009)28,2662-2676)。
[0184]用于表征对于12A5-5的结合来说重要的表位的一般性手段涉及用蛋白酶和/或化 学试剂将人肌肉生长抑制素片段化为多条肽，测定多条人肌肉生长抑制素肽的序列，分离 这些肽，并使用基于BIAcore?的竞争检验测试它们每条结合12A5-5的能力。使用已经用 12A5-5预孵育(这导致对结合区附近的蛋白质水解位点的保护(通过肽图谱(mapping)检测 的））的人肌肉生长抑制素，进行使用类似的蛋白质水解消化的进一步研究。对于人肌肉生 长抑制素的蛋白质水解的抗体保护导致被抗体保护免遭蛋白质水解的那些肽的信号减少， 以及从HPLC(高效液相色谱)肽图谱分离之后产生结合抗体的肽。得到的数据由此允许测定 对于12A5-5与肌肉生长抑制素的高亲和性结合来说重要的区。
[0185] 肽分离和鉴定
[0186]对肽消化物进行HPLC肽图谱化；收集各个峰；通过电喷雾离子化(ESI )LC_MS/MS (液相色谱-质谱/质谱)肽图谱分析、通过基质辅助的激光解吸质谱(MALDI-MS)和/或通过 N-末端测序，来对肽进行鉴定和图谱化。用于这些研究的所有HPLC分析都使用反相C18柱 (0.5mm i.d.x 25cm长；Z〇i'bi.lX?300SB;5微米；Agilent Technologies,Santa Clara, CA)来进行。HPLC肽图谱分析用多步线性梯度来发展，所述梯度为从0.1%三氟乙酸(移动相 A)至0.1三氟乙酸中的90%乙腈(移动相B)。以98%的移动相A/2%移动相B平衡柱，以15微 升/分钟的流速在100分钟的程序化梯度洗脱上使柱发展，所述程序化梯度洗脱