循环式单细胞捕获芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微流控技术领域，特别是涉及一种循环式单细胞捕获芯片。
【背景技术】
[0002]随着生物技术研究手段的不断发展，生物学的研究层面正从细胞种群向单细胞层面深化拓展。每个细胞在时空上都是独一无二的，尽管它们可能来自同一祖先，但是不同的时空环境决定了它们各自特异的遗传表达，从而产生了不同的生物性状，这对于进化、耐药性、基因表达等研究具有重要价值。然而基于细胞种群的分析方法往往会掩盖群体内不同细胞间出现的差异，忽略这些少量但重要的信息。因此迫切需要研发基于单细胞的培养及分析方法，用来研究不同细胞个体间的差异性，了解细胞的遗传与代谢机制。
[0003]从大量细胞中获得单个细胞是进行单细胞培养与分析的第一步。传统的单细胞获取方法常采用对细胞群进行大量稀释或者显微操作的方法来进行。整个操作步骤复杂繁琐，单细胞获得效率低。微流控技术是上世纪九十年代在分析化学领域发展起来的，它以微管道网络微结构特征，通过微加工技术将微管道、微泵、微阀、微储液器、微检测元件等功能元器件像集成电路一样，集成在芯片材料上。微流控技术在分离捕获单细胞方面很高的效率，通过在芯片上制作微孔、微筛、微电极等结构，能够在较短时间捕获大量单细胞，在单细胞捕获培养研究方面已经有多个成功的应用范例。
[0004]美国专利申请US20120009671A1中描述了一种基于微孔的单细胞捕获方案，该芯片上有上千个160 μ?? (长)X 160 μ?? (宽)X 160 μπι (深)的微孔，各微孔顶部均有液体管道相连，捕获前，先将细胞浓度稀释到合适水平，然后将稀释的细胞液注入液体管道，使各微孔充满液体后停止注入细胞液，此时液体管道中的细胞在重力作用下沉入微孔，通过调整细胞液的稀释度可以确保约有10%~30%的微孔中含有单个细胞。捕获的单细胞在微孔中进行培养，培养液更换则通过以每秒2 _的速度注入培养液来实现。此芯片能够实现160~480个单元的单细胞培养。
[0005]针对上述单细胞捕获方案，由于单个细胞捕获是基于单细胞在平面上的均匀分布实现的，这就需要调整输入细胞的浓度，使单个微孔的水平区域仅含有一个细胞，尽管如此，多数微孔或是未捕获到细胞，或是捕获到两个及以上的细胞，能够捕获到单个细胞的微孔数量比例仍然比较低(10~30%)。而且，微孔中细胞捕获数量的不确定性使得必须要通过显微成像对所有微孔区域的细胞数量进行判别，从中挑出少数具有单个细胞的微孔，整个判别过程耗时且工作量比较大。另外，由于仅靠重力将单细胞捕获在微孔中，捕获力较弱，细胞容易随高流速的液流而流失，因此在培养液换液时，液流流速需要控制在每秒2mm以下，这增加实验过程的复杂性，提高操作难度大。从总体看，由于细胞捕获依赖于微孔中的流场分布，这对于微孔的形制有较大要求；由于微孔不仅作为捕获结构，还需要作为培养结构，因此特定的微孔形制也决定了有限的细胞培养空间结构。
[0006]已公开的技术文献(Lab Chip, 2012，12，765)公开了一种基于微筛的单细胞捕获芯片，该芯片具有多个串联圆形腔室，每个腔室中央有一对由两个微柱组成的微筛结构。当细胞注入腔室时，单个细胞会被阻滞于微筛处，从而被捕获，进而微筛外围的上方的圆形微阀通过加压，阀膜向下方的液体管道弯曲形变，将微筛区域与外界液体管道隔离，形成一独立腔室，捕获的单细胞即在其中培养生长。换液操作时，微阀开放数百毫秒后再次快速关闭，微阀隔离区域外的新液在此数百毫秒短时间内扩散进入微阀隔离区域内。该芯片在输入细胞数量为10000~25000个条件下，约有75%的微筛能够捕获到单细胞。由于需要细胞与液流管道中的微筛接触才能捕获单个细胞，因此捕获成功很大程度上取决于细胞与微筛接触的机率。然而由于微筛的横向直径很小，大部分细胞与微筛接触的机率很小，大都会绕过微筛，最后流出芯片。为了能够实现一定的被捕获单细胞数量，需要输入较多量的细胞，在该文献中，细胞数量约为10000~25000个，细胞输入数量需求高，这对于一些数量少的细胞样品而言，难以适用。同时，该芯片上捕获到单细胞的微筛仅占70%，为了获得尽可能多的单细胞，需要进一步提升微筛捕获效率。本发明因此而来。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提出一种捕获单个细胞的循环式单细胞捕获芯片，该芯片通过液体循环流动，从中捕获单个细胞的芯片方案，通过该芯片，能够从注入的少量细胞中捕获得到多个单细胞。
[0008]为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案如下:
一种循环式单细胞捕获芯片，包括:
液流层，包含环状液流管道，所述液流管道分别通过液流输入管道、液流输出管道与芯片外部连通，且所述液流输入管道和液流输出管道上还分别设有用以将所述液流管道与外界隔离的微阀；
微筛，至少用以截留流经所述液流管道的液流内的单个细胞；
微泵，至少用以驱使液流在所述液流管道内单向循环流动。
[0009]进一步的，所述微阀可设置在所述微筛的上游或者下游。
[0010]进一步的，所述微筛包括连接在液流管道管壁上的一个以上微柱组，所述微柱组包括一个以上微柱，且其中一个微柱与液流管道管壁之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙，或者其中两个微柱之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙。
[0011]进一步的，所述芯片包括设于所述液流层上的弹性膜层，所述弹性膜层包括弹性膜。
[0012]进一步的，所述微筛包括连接在所述弹性膜暴露于所述液流管道内的局部表面上的一个以上微柱组，所述微柱组包括一个以上微柱，且其中一个微柱与液流管道管壁之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙，或者其中两个微柱之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙。
[0013]进一步的，所述微柱的形状可选自但不限于圆柱形、长方体、梯台、圆锥体、开放式槽型结构(例如，新月形结构)的一种或者两种以上的任意组合。
[0014]进一步的，所述芯片还包括设置在所述弹性膜层上的气动控制层，所述微泵包括分布于所述气动控制层内的两条以上第三气动控制管道，当在设定时段向其中两条以上第三气动控制管道内分别输入具有不同压力的流体时，该两条以上第三气动控制管道能够分别驱使所述弹性膜的不同局部区域产生不同程度的形变和/或位移，从而在液流管道内产生能够驱使液流单向流动的力。
[0015]进一步的，所述微阀包括能够驱使弹性膜的局部区域挤压液流输入管道和/或液流输出管道，从而在所述液流输入管道和/或液流输出管道内的选定位置阻断液流的驱动机构。
[0016]进一步的，所述驱动机构至少可选自但不限于电致动机构、磁致动机构、光致动机构、液压驱动机构或气动机构O
[0017]进一步的，所述芯片还包括设置在所述弹性膜层上的气动控制层，所述微阀包括分布于所述气动控制层内的至少一第一气动控制管道和至少一第二气动控制管道，当在设定时段向所述第一气动控制管道或第二气动控制管道内输入具有设定压力的流体时，所述第一气动控制管道或第二气动控制管道能够驱使所述弹性膜的局部区域挤压液流输入管道和/或液流输出管道，从而在所述液流输入管道或液流输出管道内的选定位置阻断液流。
[0018]其中，所述第一气动控制管道和第二气动控制管道还可一体设置，S卩，以一条与液流输入管道、液流输出管道均交叉的气动控制管道实现微阀的功能。
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