甲基营养型芽孢杆菌zbl-1在防治棉花黄萎病中应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物生防技术领域，具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌及其在防 治棉花病害中应用的技术领域。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病是世界性的重要病害之一，自1935年由引进美国斯字棉种而传入中 国，并逐年传播扩散。20世纪90年代后，该病已经蔓延到包括新疆在内的各个棉区，尤其是 1993年该病在我国各棉区大面积流行，发病面积高达267万hm 2,造成损失皮棉1亿kg(简桂 良等，2003;徐理等，2012;朱荷琴等，2012)。目前黄萎病的危害已成为我国自枯萎病得到有 效控制之后棉花生产上的第一大病害，严重影响棉花的产量，是棉花可持续生产的主要障 碍之一。
[0003] 我国主要棉区的棉花黄萎病菌以大丽轮枝菌为主(张绪振等，1981)。棉花黄萎病 病原菌变异性较大，存在明显的生理分化现象。防治困难，目前防治该病主要依靠种植耐病 品种，由于抗性种质资源缺乏导致抗病育种进展缓慢，生产上缺乏真正有效的抗病品种;化 学防治措施无法控制该病，且带来严重污染。随着对环境安全的逐渐重视以及生物菌剂防 治作用机制的深入研究，利用生物防治被认为是治理棉花黄萎病最具发展潜力的方法(马 平等，2003)。
[0004] 目前，国内外有关对于大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起棉花黄萎 病菌从生物基因、发病机理等方面都有大量记载，比如大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaAl 的用途(专利申请号为2015102972676);鉴定大丽轮枝菌致病型的方法和试剂盒及含有的 核酸和引物对(专利申请号为2013105871254);棉花的内生真菌CEF-193及其应用（专利申 请号为2014101791560)，从棉花的内生真菌入手，通过分离、筛选、鉴定、温室的生物测定， 获得对棉花黄萎病具有显著诱导免疫作用的菌株CEF-93(Acremonium alternatum)，保藏 编号为CGMCC N〇.8302，CEF-193能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，以利于工厂化 生产和推广应用。尽管通过室内抑菌试验表明，对黄萎病控制效果好。但是，该专利公开提 供的CEF-193为芳香顶孢霉真菌，本发明提供的为甲基营养型芽孢杆菌，可耐9%的NaCl; CEF-193的作用方式为诱导免疫，本发明提供的菌种作用方式为对病原菌的直接抑菌；同时 CEF-193其仅测定了室内盆栽的防效。
[0005] 对于甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)研究目前在国内外都有 大量的记载和披露，主要体现在利用自主筛选的各种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus)对于香蕉枯萎病、农作物的青枯病、炭疽病、白菜软瘤病、水稻白叶枯 病、水稻条斑病、棉花角斑病、诱腐病、黑斑病、根瘤病、黄瓜灰霉病、苹果腐烂病、禾谷镰刀 病、西瓜枯萎病生防方面都有记载，主要从对单一病原菌的防治效果的角度出发，对于解决 棉花黄萎病的防治角度不适用;对于安徽农业大学公布的一种甲基营养型芽孢杆菌株及其 应用（专利申请号为2015103366565,公开号为CN 105039204 A)，记载了一种甲基营养型芽 孢杆菌株CGMCC No. 10779在拮抗植物病原菌中的应用，尤其是在拮抗麦冬炭疽病病原菌中 的应用，并且明确指出在棉花枯萎病防治中有效果。该发明有益效果体现在:一是甲基营养 型芽孢杆菌株CGMCC No. 10779对多种植物病原菌，如西瓜枯萎病、棉花枯萎病、玉米小斑病 病原菌具有拮抗作用，尤其是对麦冬炭疽病病原菌具有非常高效的拮抗作用，是一种防治 植物病害效果高、环境友好、生物防治大的拮抗菌株，具有良好的开发应用前景。二是提供 的甲基营养型芽孢杆菌株CGMCC No . 10779耐盐能力强，在氯化钠含量达9 %的培养基上依 然能够生长，抗逆能力强，可适用于环境较为恶劣的土地，潜在应用价值高。但是该筛选的 生防菌是针对一种或几种病原菌进行抑菌能力测定，重视生防菌的广谱性，而未做生防菌 对单一病原菌不同生理小种（型）之间拮抗能力差异性的研究。同时，安徽农业大学公布一 种甲基营养型芽孢杆菌株，其保藏号为:CGMCCNo. 10779。通过公开披露的结果显示，菌株N5 与数据库中Bacillus ethylotrophicusCBMB205T(EU194897)相似性为100%，菌落形态特 征、生理生化特征、同源性和系统发育分析，菌株N5被鉴定为甲基营养型芽孢杆菌株 (Bacillus methylotrophicus)，实际上是一种与常见的甲基营养型芽孢杆菌株(Bacillus methylotrophicus)属于同种同属，通过基因分子核实，属于同一种菌种。
[0006] 生物防治不仅可降低对环境的影响，还不易产生抗药性。甲基营养型芽孢杆菌营 养简单，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有 广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，具有开发为生物防控菌剂的潜力。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中有关甲基营养型芽孢杆菌及其在防治不同地域棉花黄萎病中的 应用的相关报道较少，且现有防治技术效果差存在诸多不足的技术现状，本发明旨在为棉 花黄萎病提供具有相对高防治能力且性能稳定一种新的抗性菌株。本发明通过在土壤的菌 悬液中分离筛选出一株对大丽轮枝菌有较高抑制效果的真菌菌株ZBL-1，与常见的甲基营 养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)不同的新菌种，通过利用分离出的新菌种对 棉花黄萎病进行生物处理，并提供一种利用甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus)ZBL-lCGMCC No. 11636进行棉花黄萎病生物防治中应用技术方案，在室 内盆栽试验中ZBL-1发酵液对棉花黄萎病的防治效果为73.0%;在田间小区实验中其防治 效果为43.1%，作为棉花黄萎病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌 剂，该菌都具有很好的应用前景。
[0008] 本发明采用的主要技术方案：
[0009] 本发明土壤样品由新疆农业科学院植物保护研究所采自石河子市重病棉田地区， 将采集的土壤样品经LB培养基筛选分离，大量筛选优选出一批生长良好的生防菌株，从中 筛选出一株对防治棉花黄萎病显著的芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株ZBL-1。通过对所获菌 株进行形态特征、生理生化特性及总DNA的提取、16SrDNA的PCR扩增和序列测定及系统发育 分析，初步确定了是一株新菌，并依据其分类地位，通过优化选育驯化获得一种与常见的甲 基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)菌株存在明显不同特性的芽孢杆菌属 (Bac i 1 lus)菌株。同时，利用筛选出的菌株ZBL-1对在室内盆栽试验中对棉花黄萎病的防治 效果为73.0% ;在田间小区实验中其防治效果为43.1 %，是一种典型性突出、专一性强的生 防菌。
[0010] 本发明具体提供一种甲基营养型芽抱杆菌（Bacillus methylotrophicus)ZBL- 1CGMCC No. 11636,通过在采集的土壤样品中分离筛选和培养，获得一批芽孢杆菌属 (Bacillus sp.)，从中筛选出一株对防治棉花黄萎病方面具有突出功效的甲基营养型芽孢 杆菌ZBL-1，经微生物学分类与鉴定，属于甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus)菌株。
[0011] 具体的，本发明通过对石河子市棉花黄萎病重病棉田地区采集土壤样品，进行分 离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为ZBL-1的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于 芽孢杆菌属(Baci 1 lus sp.)菌株。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保 藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。2015年11月9日，菌种保藏号为 CGMCC No.