促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法

文档序号:9682171阅读:403来源:国知局
促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域中的一种促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法。
【背景技术】
[0002]骨组织缺损是因外伤、感染、肿瘤等因素使机体丧失一些骨质从而形成较大间隙,这一问题在临床较为常见并且较难处理。如何促进骨组织缺损的修复,一直是该领域研究人员研究的重点。近年来,随着骨组织工程技术的发展,这一问题得到了一定程度的解决。骨组织工程中种子细胞起着关键的作用。因此,种子细胞的选择至关重要,早期研究人员选用骨细胞和骨髓基质细胞,但是这些种子细胞取材困难,容易对患者造成二次伤害,并且这些细胞体外扩增能力较弱。此后,研究人员将种子细胞的目标锁定在了间充质干细胞。间充质干细胞具有多向分化的潜能,在一定的条件下可分化为成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞等成熟的细胞。脐带间充质干细胞(UC-MSC)是从脐带组织中分离出来的一种间充质干细胞,其具一下优点:脐带组织来源广泛,保证有充足的细胞来源;脐带间充质干细胞具有多向分化的潜能;脐带间充质干细胞免疫原性较低,不会引起患者自身的免疫排斥反应。脐带间充质干细胞如同其它组织来源的间充质干细胞,其成骨诱导后决定骨再生的关键转录因子(0SteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(骨桥蛋白-0ΡΝ、碱性磷酸酶-ALP)的基因表达均上调,但是成骨诱导这一过程需要至少14天的时间。因此,如何缩短成骨诱导时间或避免成骨诱导的步骤,显的尤为重要。

【发明内容】

[0003]本发明的目的在于提供一种促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因表达上调的培养体系,采用本发明的培养体系培养的脐带间充质干细胞依然保持着较高的干性;采用本发明的培养体系培养的脐带间充质干细胞作为种子细胞用于骨组织工程治疗骨缺损,避免了脐带间充质干细胞体外成骨诱导的步骤,为临床应用骨组织工程治疗骨缺损缩短了至少14天的时间。
[0004]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0005]—种促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法,步骤如下:
[0006]⑴脐带间充质干细胞的分离:获取无菌的脐带组织,无菌条件下剥离脐带组织的外膜和脐带组织内动、静脉,分离出脐带华通氏胶并剪碎至2-3_3,将剪碎的华通氏胶贴于培养瓶底面,l_4h后向培养瓶内添加适量培养液,培养液分别采用a-MEM+10 %FBS和a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1 ;
[0007]⑵脐带间充质干细胞的消化、传代,待脐带间充质干细胞长至80%时,采用0.05%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA对其进行消化,以1 X 104cells/cm2传至新的培养瓶中;
[0008]而且,取两种培养体系培养的第三代脐带间充质干细胞进行流式鉴定,两种培养体系培养的脐带间充质干细胞阳性率均高于95%,阴性率均低于5% ;
[0009]而且,取第三代脐带间充质干细胞,提取RNA-反转录获得cDNA-进行Q-PCR,比较两种培养体系培养的脐带间充质干细胞成骨再生相关的转录因子Osterix和RUNX基因和骨再生早期典型代表因子基因0PN和ALP的表达量。
[0010]一种促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达体系,a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1。
[0011]本发明的有益效果是:
[0012]⑴本发明采用一种新的培养体系,从脐带间充质干细胞原代开始用该培养体系进行培养,与传统的培养体系相比较,本发明采用的培养体系培养出的脐带间充质干细胞内决定成骨再生的关键转录因子(OsteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)的基因明显高表达。
[0013]⑵应用本发明的培养体系可以促进脐带间充质干细胞成骨再生的转录因子(OsteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)高表达,为骨缺损修复提供合适的种子细胞。
[0014]⑶本发明采用的一种新的培养方法,在脐带间充质干细胞正常培养时使用本发明的培养体系,脐带间充质干细胞在维持其原有干性的同时,决定成骨再生的相关因子的基因表达上调,为应用骨组织工程治疗骨缺损提供了必要的种子细胞,也为骨组织工程治疗骨缺损缩短了时间。
[0015]⑷采用本发明的培养体系培养脐带间充质干细胞,提高了成骨再生关键转录因子(Osterix、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)的基因的表达;
[0016](5)采用本发明的培养体系培养的脐带间充质干细胞依然保持着较高的干性;采用本发明的培养体系培养的脐带间充质干细胞作为种子细胞用于骨组织工程治疗骨缺损,避免了脐带间充质干细胞体外成骨诱导的步骤,为临床应用骨组织工程治疗骨缺损缩短了至少14天的时间。
【附图说明】
[0017]图1为08七6^1的1111?熟表达水平(相对荧光强度);
[0018]图2为RUNX的mRNA表达水平(相对荧光强度);
[0019]图3为0ΡΝ的mRNA表达水平(相对荧光强度);
[0020]图4为ALP的的mRNA表达水平(相对荧光强度);
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述,以下实施例只是描述性的,不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围。
[0022]—种促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法,步骤如下:
[0023]⑴脐带间充质干细胞的分离:获取无菌的脐带组织,无菌条件下剥离脐带组织的外膜和脐带组织内动、静脉,分离出脐带华通氏胶并剪碎至2-3_3,将剪碎的华通氏胶贴于培养瓶底面,l_4h后向培养瓶内添加适量培养液,培养液分别采用a-MEM+10 %FBS和a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1 ;
[0024]⑵脐带间充质干细胞的消化、传代,待脐带间充质干细胞长至80%时,采用0.05%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA对其进行消化,以1 X 104cells/cm2传至新的培养瓶中;
[0025]⑶取两种培养体系培养的第三代脐带间充质干细胞进行流式鉴定,两种培养体系培养的脐带间充质干细胞阳性率均高于95%,阴性率均低于5% ;
[0026]⑷取培养到第三代脐带间充质干细胞,提取RNA-反转录获得cDNA-进行Q-PCR,比较两种培养体系培养的脐带间充质干细胞成骨再生相关的转录因子(OsteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)基因的表达量。
【主权项】
1.一种促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法,其特征在于:步骤如下: ⑴脐带间充质干细胞的分离:获取无菌的脐带组织,无菌条件下剥离脐带组织的外膜和脐带组织内动、静脉,分离出脐带华通氏胶并剪碎至2-3_3,将剪碎的华通氏胶贴于培养瓶底面,l_4h后向培养瓶内添加适量培养液,培养液分别采用a-MEM+10 %FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1 ; ⑵脐带间充质干细胞的消化、传代,待脐带间充质干细胞长至80 %时,采用0.05 %的胰蛋白酶+0.02%的EDTA对其进行消化,以1 X 104cells/cm2传至新的培养瓶中。2.根据权利要求1所述的促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法,其特征在于:取两种培养体系培养的第三代脐带间充质干细胞进行流式鉴定,两种培养体系培养的脐带间充质干细胞阳性率均高于95%,阴性率均低于5%。3.根据权利要求1所述的促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法,其特征在于:取第三代脐带间充质干细胞,提取RNA-反转录获得cDNA-进行Q-PCR,比较两种培养体系培养的脐带间充质干细胞成骨再生相关的转录因子Osterix和RUNX基因和骨再生早期典型代表因子基因0PN和ALP的表达量。4.一种促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达体系,其特征在于:a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1。
【专利摘要】本发明涉及一种促进脐带间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法,步骤如下:脐带间充质干细胞的分离:获取无菌的脐带,经过前处理用培养液重悬沉淀,计数,以1×106/cm2接种至培养瓶中培养,培养液分别采用a-MEM+10%FBS和a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1。采用本发明的培养体系培养的脐带间充质干细胞作为种子细胞用于骨组织工程治疗骨缺损,避免了脐带间充质干细胞体外成骨诱导的步骤,为临床应用骨组织工程治疗骨缺损缩短了至少14天的时间。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105441388
【申请号】CN201510933962
【发明人】赵刚, 马洁, 刘微微, 高伟玮
【申请人】天津市康婷生物工程有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月15日
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