一种土壤样品中微生物基因组的快速提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体地说，特别涉及一种土壤样品中微生物基因组的快速提取方法。
技术背景
[0002]土壤中的微生物是一个综合体系，每克土壤(湿重)中大概有10的十次方到十一次方个微生物，而其中99%以上不可培养。传统的土壤微生物群落的分析是利用微生物计数、分离培养、富集培养，并通过微生物代谢产物的生理生化分析来确定微生物的种类，从而确定土壤中有害、有益微生物的情况，再有针对性的进行优势有益土壤微生物生态群落的构建。但是常规的微生物分离培养技术有很大的局限性，因为目前的分离方法可分离出的微生物种类仅占土壤微生物种类总数的0.1-1%，许多微生物不能被分离和鉴定;所以利用传统的培养法仅能得到土壤生态系统中少量的微生物群落的信息，许多“存活但不能被培养”微生物信息丢失。此外，利用传统方法来确定微生物种类时消耗时间较长，需要做梯度稀释(一般为5-7个稀释度)，并需要3-5个平行重复，因而工作量巨大，很难做到快速检测和规模化操作。
[0003]目前可以通过分子生物学手段进行土壤微生物生态群落检测分析，如16SrRNA基因序列分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)等等。这些分子生物学检测方法能更全面地反映出土壤微生物的信息。在进行分子生物学分析时，首先需要从土壤中提取高质量的微生物总基因组DNA。土壤中的无机盐、有机物需要事先分离处理;此外，在DNA提取过程中残留的腐殖酸和重金属也会对后期分析生物学分析造成影响。
[0004]基于上述内容，需要开发一种快速提取土壤样品中的微生物基因组的方法，以用于通过分子生物学手段对土壤中微生物菌落进行深入分析。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种从土壤样品中快速提取微生物基因组的方法。本方法对于土壤样品中的微生物基因组通过物理研磨、酶解破碎、化学抽提、硅胶膜吸附纯化，得到高质量的微生物基因组，从而用于后续的分子生物学检测。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的，一种土壤样品中微生物基因组的快速提取方法，其特征在于，包括以下基本步骤:
A)将土壤样品在液氮环境中研磨粉碎；
B)在粉碎后的土壤样品中加入土壤微生物基因组提取缓冲液，37°C水浴中温育30min;
C)然后分别加入蛋白酶K溶液和SDS溶液，55°C水浴30min;
D)离心弃沉淀，收集上清液；
E)用苯酚第一次抽提，离心后收集上清液；
F)再用苯酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提，离心后收集上清液； G)向上述上清液中加入2倍体积的乙醇或0.8倍体积的异丙醇，混匀后，将全部液体离心通过DNA回收纯化柱；
H)回收纯化柱再次经离心干燥；
I)最后加入DNA洗脱液，室温孵育l-2min，经离心得到微生物基因组样品。
[0007]所述步骤B中，土壤微生物基因组提取缓冲液的工作浓度溶液中包括0.2M NaCl、0.05M EDTA、0.15 Tris_HCl和l_2mg/ml溶菌酶;并在加入后振荡3_5min，随之再进行37°C水浴。
[0008]所述步骤C中，加入蛋白酶K至其工作浓度为0.02-0.05mg/ml、SDS工作溶液浓度为
0.2-0.5%;并在加入后，轻微混匀，随之进行55°C水浴。
[0009]所述步骤D中的离心速度为10000-12000 rpm，离心5_10min，离心机设定温度为4V。
[0010]所述步骤E中，用苯酚抽提的时间为5-10min;抽提后离心速度为10000-12000rpm，离心5-10min，离心机设定温度为4°C。
[0011]所述步骤F中的苯酚、氯仿和异戊醇混合液中各项的体积比为25:24:1;抽提的时间为5-10min;抽提后离心速度为10000-12000 rpm，离心5_10min，离心机设定温度为4°C。若完成该步骤后，上清液仍浑浊或者有少量蛋白残留，可以重复此步骤一遍。
[0012]所述步骤G中，离心速度为10000-12000 rpm，离心3_5min，离心机设定温度为4°C。
[0013]所述步骤Η中，需要将回收纯化柱放置新的收集管中，离心速度为10000-12000rpm，离心1 _2min，离心机设定温度为4°C。
[0014]所述步骤I中，DNA洗脱液为10 mM Tris-Cl, pH值在7.5-8.5之间。加入洗脱液后，室温孵育l_2min，随后离心收集微生物基因组样品(离心速度为10000-12000 rpm，离心1-2min，离心机设定温度为4°C)。
[0015]与现有技术相比，本发明的优点在于:
1、本发明对于土壤样品的粉碎是在液氮中完成的。其低温导致土壤机构疏松，方便研磨，使微生物细胞破碎，使DNA释放完全;并且低温情况下各酶处于低活性状态，有利于抑制DNAase的作用，保护土壤微生物基因组。
[0016]2、本发明通过物理研磨、酶解破碎、化学抽提、硅胶膜吸附纯化步骤提取土壤微生物基因组，采用的步骤较少而且试剂简单，整个过程耗时2h左右，节约了时间。
[0017]3、本方法为直接法从土壤中提取微生物基因组，不涉及DNA的反复溶解，提高了产量，提取的基因组的产量可以达到80ug/g;DNA完整性高，大小在23kb以上；没有RNA或者蛋白质的污染，0D260/0D280接近标准值。
【附图说明】
[0018]图1为土壤微生物基因组凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0020]实施例1
土壤样品:小麦田小麦根系周围土壤，采样时为小麦已成熟即将开镰。[0021 ]分离提取土壤微生物基因组的具体过程如下:
(1)将2g的土壤样品在液氮中研磨粉碎；
(2)将研磨好的样品置于10ml离心管中，加入基因组提取缓冲液(包括0.2M NaCl、
0.05M EDTA,0.15 Tris-HCl和lmg/ml溶菌酶)，振荡3min，混匀后，37°C水浴中温育30min;
(3)向溶液中，分别加入蛋白酶K溶液和SDS溶液至终浓度为0.02mg/ml和0.2%，轻微混匀，55°C 水浴 30min;
(4)4°C情况下，lOOOOrpm，离心5min，收集上清液；
(5)上清液用等体积的苯酚，室温抽提5min;
(6)4°C情况下，lOOOOrpm，离心5min，离心后收集上层水相；
(7)向收集得到的上层水相中加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液(三者的体积比为25:24:1),室温抽提5min ；
(8)4°C情况下，lOOOOrpm，离心5min，离心后收集上层水相；
(9)向收集得到的上层水相中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，将全部液体离心通过DNA回收纯化柱;离心速度为lOOOOrpm，离心3min，离心机设定温度为4°C;
(10)回收纯化柱放置在新的干燥的收集管上，再次经高速离心干燥，离心速度为lOOOOrpm，离心lmin，离心机设定温度为4°C ；
(11)加入适量的DNA洗脱液(10mM Tris-Cl , pH值7.5)，经离心(离心速度为lOOOOrpm，离心lmin，离心机设定温度为4°C)得到微生物基因组样品。
[0022]用分光光度计测得提取额土壤微生物基因组的0