一种提取rna的提取液和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及核酸的提取。
【背景技术】
[0002] 分子生物学实验经常需要从样品中提取核酸物质，用于后续的PCR扩增。目前，提 取DNA通常采用水煮法，即，通过水煮10-20分钟裂解样品，利用EDTA、Chele X-100树脂等螯 合剂螯合掉样品裂解后所释放的干扰后续PCR反应的金属离子，从而得到可用于PCR反应的 DNA。水煮法具有简便、易操作、核酸提取率高等特点，广泛应用于疾控、法医等领域(杨电， 刘超，徐曲毅，胡慧英.Chelex-100法提取脱落细胞检材DNA的实时定量研究[J].刑事技术 .2009(05);钱雪琴，张军，沈芳.Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较[J].中国 卫生检验杂志.2008(08)) ANA通常用TRIzol法、硅胶柱和磁珠法等方法提取(Trizol:美国 专利号5346994;钟海军，唐孝亮，曾刚毅.核酸纯化柱提取核酸定量检测丙型肝炎病毒RNA 的临床应用[J ].检验医学与临床.2008 (13);何世成，林源，王昌建，刘道新，谭丹，唐小明， 王卫国，鲁杏华，邱立新，何玉玲.五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的 比较.[J].中国动物检疫.2014(8))。然而TRIzol法中使用的重蒸酚具有毒性;硅胶法、磁珠 法等费用较高，且提取率不高；而普通的水煮法无法直接用于提取RNA，主要是因为样品中 存在内源性的RNA酶，而这些RNA酶会将RNA降解。因此，本领域需要一种能够简便易操作且 能够高效率提取RNA的方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种可以用于水煮法提取RNA的提取液以及一种水煮法提取 RNA的方法，以解决水煮法不能提取用于PCR的RNA的问题。
[0004] 本发明的一个方面是提供一种RNA提取液，用于提取病毒（包括但不限于流感病 毒)拭子、全血等样品中的RNA，所述提取液包含RNA酶抑制剂、阳离子螯合剂、去污剂和反应 缓冲液等成分，其中所述RNA酶抑制剂为尿素和氧钒核糖核酸复合物中的一种或几种的组 合，所述阳离子螯合剂为EDTA、8-羟基喹啉螯合树脂、聚苯乙稀吡啶树脂、Chelex-100树脂、 壳聚糖改性树脂、冠醚树脂和丝瓜络中的一种或几种的组合，所述去污剂是吐温20、 Triton-XlOO和对羟基苯甲酸甲酯中的一种或几种的组合，所述反应缓冲液是醋酸钾/冰醋 酸缓冲液、氯化钾/HC1缓冲液、甘氨酸/盐酸缓冲液或HAc/NaAc缓冲液。
[0005] 优选地，所述尿素的浓度是1~4M;更优选地，尿素的浓度是2.2M。
[0006] 优选地，所述氧钒核糖核酸复合物的浓度是10~100mM;更优选地，氧钒核糖核酸 复合物的浓度是30mM。
[0007] 优选地，所述EDTA的浓度是0.1~5mM;更优选地，所述EDTA的浓度是1.5mM。
[0008] 优选地，所述8-羟基喹啉螯合树脂的浓度是5 %~10 % W/V，更优选地，8-羟基喹啉 螯合树脂的浓度是8 % W/V。
[0009] 优选地，所述聚苯乙烯吡啶树脂的浓度是5 %~10 % W/V，更优选地，聚苯乙烯吡啶 树脂的浓度是8%W/V。
[0010] 优选地，所述Chelex-100树脂的浓度是5%~10%W/V，更优选地，Chelex-100树脂 的浓度是8%W/V。
[0011] 优选地，所述壳聚糖改性树脂的浓度是5 %~10 % W/V，更优选地，壳聚糖改性树脂 的浓度是8%W/V。
[0012] 优选地，所述冠醚树脂的浓度是5%~10%W/V，更优选地，冠醚树脂的浓度是8% ff/Vo
[0013] 优选地，所述丝瓜络的浓度是5 %~10 % W/V，更优选地，丝瓜络的浓度是8 % W/V。 [0014] 优选地，所述吐温20的浓度是0.1 %~2 % W/V，更优选地，吐温20的浓度是0.5 % W/ V。
[0015] 优选地，所述Triton-ΧΙΟΟ的浓度是0.1%~2%1八，更优选地，1^切111100的浓 度是 0.5%W/V。
[0016] 优选地，所述对羟基苯甲酸甲酯的浓度是0.1 %~0.2 % W/V，更优选地，对羟基苯 甲酸甲酯的浓度是〇. 1 % W/V。
[0017]优选地，所述醋酸钾/冰醋酸缓冲液的浓度(钾离子浓度)是20~500mM，更优选地， 浓度是100mM;该缓冲液的pH值范围是4.0~5.5，更优选地，pH值是4.8。
[0018]优选地，所述氯化钾/HC1缓冲液的浓度(钾离子浓度)是20~500mM，更优选地，浓 度是100mM;该缓冲液pH值范围是4.0~5.5，更优选地，pH值是4.8。
[0019 ]优选地，所述甘氨酸/盐酸缓冲液的浓度(甘氨酸浓度)是10~100mM，更优选地，浓 度是50mM;该缓冲液pH值范围是4.0~5.5，更优选地，pH值是4.8。
[0020] 优选地，所述HAc-NaAc缓冲液的浓度(钠离子浓度）是50~500mM，更优选地，浓度 是200mM;该缓冲液的pH值范围是4.0~5.5，更优选地，pH值是4.8。
[0021] 进一步地，一种优选的提取液的成分为：尿素2.2M，氧钒核糖核酸复合物30mM， EDTA 1.5mM，Chelex-100 树脂 8%W/V，吐温 200.5%W/V，TritonX-1000.5%W/V，对羟基苯甲 酸甲酯〇. 1 %W/V，甘氨酸/盐酸缓冲液(甘氨酸浓度)50mM，pH 4.8。
[0022] 本发明的第二个方面提供一种提取RNA的方法，包括：向样品中加入本发明的RNA 提取液，样品与RNA提取液的体积比为3:1，95~100°C加热5~20min，取出后用振荡器剧烈 振荡，12000 ~14000rpm 离心 15 ~30s。
[0023] 本发明的第三个方面是提供一种提取RNA的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的RNA 提取液。
[0024] 本发明的第四个方面是提供本发明的RNA提取液在水煮法提取RNA中的应用。
[0025] 本发明的方法中，依靠高温水煮来裂解样品并释放核酸。释放核酸的同时，会有一 部分杂质阳离子也被释放出来，这部分离子会干扰实验，用阳离子螯合剂螯合掉；同时用去 污剂去除样本中的脂质、脂蛋白等。缓冲液选择酸性条件的缓冲液，且不含磷酸根、柠檬酸 根等可能与Mg离子结合沉淀的离子。释放核酸的同时，会有内源性RNA酶释放出来。选用合 适的抑制剂，如尿素或氧钒核糖核酸复合物等，既能灭活RNA酶(尿素可以变性蛋白），又不 会干扰后面的PCR反应(Taq酶可以耐受），从而避免RNA被降解，仅利用水煮法即可获得能够 用于PCR反应的RNA，使得RNA的提取简单易行，成本降低。
【附图说明】
[0026] 图1是TRIzol法(Thermo Fisher货号：15596-026,按说明书操作）提取禽流感病毒 H5亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图；
[0027]图2是利用本发明的水煮法提取禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩 增图；
[0028] 图3是TRIzol法(Thermo Fisher货号：15596-026,按说明书操作）提取禽流感病毒 H7N9亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图；
[0029]图4是利用本发明的水煮法提取禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR 扩增图；
[0030] 图5是阴性对照结果图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体的实施方式说明本