一种核酸标记方法及标记产物和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种核酸标记方法及标记产物和应 用。
【背景技术】
[0002] DNA文库构建是测序的最基本要求，现有的DNA文库构建都是以小片段DNA (〈1Kb) 作为插入序列，其基本流程是：片段末端修复，末端"A"碱基连接和末端接头连接。该接头 是一段已知序列的短片段（<l〇〇bp) DNA双链，接头连接完成后就可以用特异性退火到接头 上的引物对目标序列进行扩增。
[0003] 上述方法虽然对于小片段DNA非常有效，但是无法对长片段DNA (10Kb~1Mb)末 端进行标记，因为在接头连接之前的末端修复和末端"A"碱基连接的过程中对DNA的操作 均会造成DNA分子长片段的断裂，造成假阳性末端。此外，之前的DNA提取过程和之后的缺 口平移等过程也涉及对长片段DNA的操作，也会引起长片段DNA分子的断裂。这些断裂的 发生导致长片段DNA文库构建的失败，或者文库质量的降低，进而影响随后的全基因组扩 增和测序等。
[0004] 对长片段DNA的内部碱基进行修饰，比如甲基化修饰、乙酰化修饰、磷酸化修饰和 生物素化标记等，也会造成长片段DNA断裂的问题。此外，长片段末端自连接也是核酸标记 反应中常发生的现象，一般需要采取特定的化学修饰才能一定程度上避免。
[0005] 因此，能够成功实现长片段DNA标记是目前DNA文库构建、全基因组扩增和测序以 及内部碱基修饰等操作的迫切需求。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种核酸标记方法及标记产物和应用，该核酸标记方法对长片段核酸 采取保护措施，保证长片段核酸免于断裂，并且不会发生自连接，成功实现长片段核酸的标 记。
[0007] 根据本发明的第一方面，本发明提供一种核酸标记方法，该方法包括将核酸固定 于琼脂糖凝胶内，在所述琼脂糖凝胶内对所述核酸进行标记。
[0008] 在第一方面中，琼脂糖凝胶对核酸片段具有固定和保护功能，核酸片段能够免受 那种在溶液中遭受机械剪切力等作用力而发生的断裂；并且由于琼脂糖凝胶具有交联结构 形式的疏松多孔结构，使标记反应所需的各种离子和酶等能在琼脂糖凝胶内自由扩散从而 完成标记。也就是说，本发明的核酸标记方法既具有固定核酸以免受断裂的优势，同时也具 有像在溶液中那样离子和酶能够自由扩散而实现标记反应的优势。
[0009] 本发明的核酸标记方法适于对核酸进行包括末端标记和内部碱基修饰在内的任 何标记反应，其中末端标记包括并不限于对核酸进行末端修复、接头连接和/或末端基团 标记；内部碱基修饰包括并不限于甲基化修饰、乙酰化修饰、磷酸化修饰和生物素化标记 等。所谓"内部碱基修饰"是指对核酸进行的除末端碱基以外的任何碱基的修饰。
[0010] 毫无疑问本发明的核酸标记方法适于对各种长度的核酸片段进行标记。但是作为 本发明的优选方案，所述核酸的长度在l〇Kb以上，优选10Kb~1Mb之间，这种长度的核酸 在本发明中称作长片段核酸。
[0011] 本发明的核酸标记方法适于各种类型的核酸片段，包括并不限于单链和双链的 DNA，因为各种类型的长片段核酸都存在容易断裂的问题，而本发明中的琼脂糖凝胶正好可 以固定长片段核酸而使其免于断裂。其中，双链DNA典型地包括基因组DNA和RNA反转录 成的cDNA，优选基因组DNA ;单链DNA典型地包括热变性处理得到的DNA。作为本发明的优 选，双链DNA是本发明所述方法的最适对象。
[0012] 作为本发明的优选方案，本发明的核酸末端标记方法中，末端标记包括但不限于： 在琼脂糖凝胶内对核酸进行末端修复、接头连接和/或末端基团标记。上述末端修复、接头 连接以及末端基团标记可以均在琼脂糖凝胶内进行，也可以将其中至少一个在琼脂糖凝胶 内进行。为了更充分保护长片段核酸，优选的是均在琼脂糖凝胶内进行。但是，根据实验操 作的剧烈程度，对于操作剧烈并可能使长片段核酸断裂的反应在琼脂糖凝胶内进行；对于 操作温和而不太容易使长片段核酸断裂的反应可以在溶液中进行。
[0013] 末端修复一般是指末端补平，因为本发明使用的核酸比如双链DNA，可以是细胞裂 解后的DNA，也可以是基因组DNA经过限制性内切酶酶切后的片段，还可以是基因组DNA经 过DNasel酶切后的产物，甚至是RNA经反转录得到的cDNA等，这些DNA片段两端都可能带 有1个或多个粘性末端，在进行平末端接头连接之前就需要先进行末端补平。本发明的一 个实施例中采用T4DNA聚合酶进行末端补平。接头连接所用的接头可以是合成的核酸序列 或者PCR扩增产物，通常长度可以在10bp-4kbp之间，一般需要保证接头的5'端是去磷酸 化的，以防止接头自连接。接头连接可以是平末端接头连接或粘性末端接头连接，平末端接 头连接是将末端补平后的核酸片段与平末端的接头进行连接；粘性末端接头连接可以是将 采用内切酶酶切后的核酸片段与采用相同内切酶酶切后接头连接。本发明的一个实施例 采用平末端接头连接。末端基团标记比如可以是末端加"A"，如使用Taq酶催化的末端加 "A";或者末端生物素标记，如使用脱氧核苷末端转移酶将生物素标记的dUTP连接在DNA的 3'羟基，来标记单链或标记双链的突出末端或者平末端；或者使用地高辛标记的UTP来标 记单链RNA的末端；等等。
[0014] 作为本发明的优选方案，所述末端标记包括：在所述琼脂糖凝胶内对所述核酸进 行末端修复形成平末端和平末端接头连接。
[0015] 为了最大限度地保护核酸免受断裂，希望DNA从细胞内释放开始就使用琼脂糖凝 胶固定DNA，因此作为本发明的优选方案，在所述末端修复形成平末端之前，还包括：在裂 解液中初步裂解细胞并酶切DNA，以及在琼脂糖凝胶内完全裂解细胞释放出DNA。初步裂 解细胞使用的裂解液一般是温和的裂解液，仅使得细胞部分破裂，DNA部分裸露；可以使用 DNasel等酶切DNA，得到长片段DNA片段。当然，也可以直接使用细胞裂解后释放出来的 DNA，或再使用限制性内切酶（例如，甲基化敏感的限制性内切酶）进行酶切，甚至DNA可以 是提取纯化后酶切或者超声波物理打断的产物。本发明的一个实施例使用含0. 1% NP-40 的裂解液对细胞进行弱裂解，然后用DNasel酶切10分钟后加入EDTA终止反应。接下来将 初步裂解的细胞固定于琼脂糖凝胶内，并用相对剧烈的裂解液（如含SDS的裂解液）完全 裂解细胞以释放出DNA，由于琼脂糖凝胶对DNA的固定作用，使其免受断裂。
[0016] 本发明的核酸末端标记方法中，一般在平末端接头连接之后还要补平存在的缺 口，因此作为本发明的优选方案，在所述平末端接头连接之后，还包括：在所述琼脂糖凝胶 内进行缺口平移（nick translation)反应。缺口平移反应也在琼脂糖凝胶内进行，从而最 大限度地保护核酸免受断裂。
[0017] 本发明的核酸末端标记方法中，核酸来源不受限制，任何来源于动物、植物或微生 物的核酸均可用本发明的方法进行末端标记。相应的，接头连接使用的接头来源也不受限 制。但是作为本发明的优选方案，所述接头连接使用的接头为与所述核酸异源的接头。本 发明一个实施例中以人的基因组DNA作为长片段核酸来源，而使用质粒PBR322的PCR产物 作为接头进行末端标记。使用与所述核酸异源的接头进行末端标记，测序后很容易区分并 且找到DNA末端。
[0018] 本发明的核酸末端标记方法中，接头的长度不受限制，短片段（<100bp)的DNA双 链接头可用于本发明，但是为了后续全基因组扩增的高效进行，可以使用较长的接头，比如 200bp以上、500bp以上、800bp以上、lkb以上、1.5kb以上，甚至2. Okb以上的接头。本发明 一个实施例中采用从质粒PBR322中PCR扩增出的一个1996bp的DNA片段作为接头。由于 末端标记反应后连接的接头较长，可以用Phi29DNA聚合酶等对产物进行高效扩增，所以可 以大大降低反应所需起始量。
[0019] 本发明所用琼脂糖凝胶的浓度可以根据核酸片段的大小适当调整，一般核酸片段 越大需要的浓度越低，而核酸片段越小需要的浓度越高。实验室常用的琼脂糖凝胶浓度一 般介于0.5-2. 0% (w/v)之间，我们以终浓度0.5-0. 8% (w/v)的琼脂糖凝胶进行实现，没 有发现明显的差异。说明本发明的琼脂糖凝胶可以在一个较宽的浓度范围内使用，这一点 本领域普通技术人员能够把握。
[0020] 根据本发明的第二方面，本发明提供一种使用如第一方面所述的核酸末端标记方 法进行标记得到的标记产物。
[0021] 根据本发明的第三方面，本发明提供如第二方面所述的标记产物在全基因组扩增 中的应用。
[0022] 与现有技术相比，本发明的核酸末端标记方法将核酸固定于琼脂糖凝胶内，在琼 脂糖凝胶内对核酸进行末端标记，利用琼脂糖凝胶的分子筛效应，一方面固定长片段核酸， 防止物理机械损伤断裂，进而造成假阳性末端被标记上；另一方面，琼脂糖凝胶的疏松多孔 结构，使末端标记反应所需的各种离子和酶等能在琼脂糖凝胶内自由扩散从而成功实现末 端标记，得到长片段核酸末端标记产物。此外，由于琼脂糖凝胶对核酸的固定作用，避免了 核酸自连接现象的发生。
【附图说明】
[0023] 图1为琼脂糖凝胶中DNA(左）和用酚氯仿抽提的DNA(右）电泳结果图，其中Ml 和M2为DNA Marker ;1为琼脂糖凝胶中DNA ;2为用酚氯仿抽提的DNA。
[0024] 图2为用脉冲场凝胶电泳检测片段长度范围的结果，其中E是DNasel酶切的实 验组；N是未加酶而在琼脂糖凝胶内裂解细胞的对照组；gDNA为用