一种校对活性酶抑制剂及其降低抑制作用的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种聚合酶抑制剂，特别涉及一种聚合酶链式反应中抑制具有校对活 性酶的某些含特定序列的寡核苷酸及其降低抑制作用的方法。 (二)
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)自从被发明之后，迅速成为 分子生物学的日常使用技术。最开始使用的耐热Taq DNA聚合酶(Taq)并不具备3 '-5 '外切 核酸酶活性，即校对活性，扩增的产物保真度较低。随后科研人员找到了几种具有校对活性 的DNA聚合酶，比如保真度最高的Pfu DNA聚合酶(Pfu)。单独使用Taq不能扩增长片段的 DNA，而单独使用Pfu虽然能够减少突变率，但其只能扩增比Taq更短的DNA片段。由于Pfu的 持续合成能力(？1'0〇68 8；^；^7)较低，8卩一个酶结合到模板上之后一次合成的碱基数比较 少，科研人员认为提高酶的持续合成能力能够改善扩增长片段的能力。1994, Barnes提出 Taq或Klentaq在复制DNA过程中容易掺入错误的碱基而使DNA链合成终止，当加入少量的 Pfu时，Pfu的校对活性能去除不配对的碱基，使DNA链合成能够继续进行，这样的混合酶能 够扩增任一单独酶都无法扩增的长片段DNA Barnes的结果表明对没有校对活性的酶来说， 持续合成能力并不是合成长片段的主要影响因素，因为Klentaq的持续合成能力比Taq酶更 低，但Klentaq的混合酶比Taq的混合酶能扩增更长的片段;加入有校对活性的酶才是最关 键的影响因素，当Klentaq与Pfu exo_(-种缺乏校对活性的Pfu突变体)混合时，则不能扩 增长片段。近几年的研究表明，提高酶的持续合成能力，尤其是对具有校对活性的DNA聚合 酶，也具有至关重要的作用，比如Pfu融合了Sso7d这个双链DNA结合结构域之后，酶的持续 合成能力大大提高，可用于扩增长片段DNA。然而，我们在用这种基因工程改造过的具有校 对活性的DNA聚合酶扩增时，仍然时不时地遇到扩增失败的问题，我们发现，其中的部分原 因是这类具有校对活性的酶能够被某些含特定序列的寡核苷酸抑制。 (三)
【发明内容】
[0003] 本发明目的是寻找抑制校对活性的耐热DNA聚合酶抑制序列，并寻找消除其抑制 作用的方法，提供一种聚合酶链式反应中抑制校对活性酶活性的抑制剂及降低抑制的方 法。
[0004] 本发明采用的技术方案是：
[0005] 本发明提供一种校对活性酶抑制剂，所述抑制剂为含有连续或不完全连续的η个G 的寡核苷酸，η为大于4的正整数，优选所述η为5~8的正整数;所述不完全连续为η个G中间 含有1个Α、Τ或C。
[0006] 进一步，所述校对活性酶抑制剂为含有下列序列之一 ：（1)GGGGGHGG，H为Α、Τ或C; (2)GGGGG;(3)GGGGGG;(4)GGGGSG，S为G或C;(5)GGGGHGG，H为Α、Τ或C;(6)GGGGGHG，H为Α、Τ或 C;(7)GGGGGH，HSA、TSC。
[0007] 本发明还提供一种降低所述校对活性酶抑制剂在聚合酶链式反应中对校对活性 酶抑制的方法，所述方法是将聚合酶链式反应体系中含有所述抑制剂的寡核苷酸序列浓度 降低至不大于0 . ΙμΜ，优选0.02~0 . ΙμΜ。
[0008] 本发明还提供一种降低所述校对活性酶抑制剂在聚合酶链式反应中对校对活性 酶抑制的方法，所述方法是向含有所述抑制剂的寡核苷酸中添加与抑制剂序列互补的寡核 苷酸。
[0009] 我们在实验中发现，用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，当PCR中有引物Stat3R或GfapR 时(所有引物信息见表格1)，我们的扩增总是失败。我们推测这两条引物具有抑制PCR的作 用。我们的实验结果表明这两条引物确实能够抑制如Phusion DNA聚合酶（以下缩写成 Phusion)、Q5DNA聚合酶（以下缩写成Q5)、Cobuddy DNA聚合酶（以下缩写成Cobuddy)、 PrimeSTAR DNA聚合酶（以下缩写成PS)、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（以下缩写成PSGXL)以 及FastPfu Fly DNA聚合酶（以下缩写成PfuFly)等具有校对活性的DNA聚合酶的活性，但不 会抑制LA Taq(以下缩写成LATaq)和Taq DNA聚合酶（以下缩写成Taq)的活性。
[0010] 我们进一步的实验发现富含鸟嘌呤(G)碱基的寡核苷酸能够对具有校对活性的 DNA聚合酶起抑制作用。当寡核苷酸中含有多个G序列时（比如GGGGHGG、GGGGG及GGGGSG等。 其中Η为A、T或C，S为G或C)，Phusion DNA聚合酶、Q5DNA聚合酶、Cobuddy DNA聚合酶、 PrimeSTAR DNA聚合酶以及PrimeSTAR GXL DNA聚合酶等酶的扩增会受到严重的抑制。
[0011] 我们发现，富含G碱基的寡核苷酸对酶的抑制作用具有剂量效应。通过下列方法可 以降低富含G碱基的寡核苷酸的抑制作用:①降低引物的使用浓度;②加入与富含G碱基序 列互补的寡核苷酸。
[0012] 表格1:寡核苷酸序列信息
[0013]
[0014]
[0015] 1:+表示抑制作用强，+/-表示有抑制作用，-表示无抑制作用
[0016] 本发明与现有技术相比所具有的有益效果主要体现在：
[0017] 本发明提供一种校对活性酶抑制剂，富含G碱基的寡核苷酸能够抑制具有校对活 性的DNA聚合酶的活性，使PCR扩增失败;通过将降低含有所述抑制剂的寡核苷酸浓度(降低 至不大于Ο.ΙμΜ)，或者将富含C碱基的寡核苷酸与富含G碱基的寡核苷酸互补配对后能够降 低其抑制作用。 (四）【附图说明】
[0018] 图1为引物Stat3R和GfapR能够抑制具有校对活性的DNA聚合酶的PCR扩增的电泳 图;A.用引物01 ig2F和01 ig2R扩增时，加入第三条引物01 ig2.6F不影响扩增效率，加入引物 Stat3R或GfapR则抑制PSG)(L和PS酶的扩增，但不抑制LATaq和Taq酶的扩增；B.用引物 pBSIIF和pBSIIR扩增pBlueScript II KS(-)质粒时，引物Stat3R和GfapR能够抑制 卩11118丨〇11、05、(：〇1311(1(17、？5、？56乂1^和?如?17酶的?0財广增，但不影响1^^39酶的扩增 ;虚线框表 示目的基因条带。
[0019] 图2为富含G序列的寡核苷酸能够抑制具有校对活性的DNA聚合酶的活性的电泳 图；A. CGCAGATC并不具有抑制酶活性的作用;B、C.逐步缩短引物Stat3R和Gf apR寻找具有抑 制活性的序列;D.富含G碱基具有抑制PCR扩增的作用。
[0020] 图3为降低富含G碱基的寡核苷酸对PCR的抑制作用电泳图；A.引物Stat3R和GfapR 对PSGXL酶的抑制作用具有剂量效应，浓度降低抑制作用减弱;B.扩增Stat3基因的编码区 时，降低引物Stat3R引物浓度，能够提高其的扩增效率;C. GGGGGG寡核苷酸能够抑制PSGXL 酶的PCR扩增，目的基因在GGGGGG浓度等于0.27μΜ时，才开始能扩增出微弱的条带。当加入 能够与GGGGGG互补配对的寡核苷酸CCCCCC时，即使GGGGGG的浓度达到0.8μΜ，仍然能扩增出 微弱的条带。 (五)【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0022] 实施例1:引物Stat3R或GfapR能够抑制具有校对活性的DNA聚合酶的活性
[0023] 我们用引物01ig2F和01ig2R扩增小鼠基因组DNA，在PCR反应体系中加入0.4μΜ第 三条引物（分别为01ig2.6F、Stat3R和GfapR，引物信息见表1)。每25yL的PCR反应体系包括 不同公司来源的DNA聚合酶（Phusion DNA聚合酶（缩写成Phusion，来源于New England Biolabs公司）、Q5DNA聚合酶（缩写成Q5,来源于New England Biolabs公司）、Cobuddy DNA 聚合酶(缩写成Cobuddy，来源于北京康为世纪生物科技有限公司）、PrimeSTAR D