一种特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程应用领域，具体涉及一种特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向 序列及应用。
【背景技术】
[0002] CRISPR_Cas9是细菌和古细菌在进化过程中演变出来的一种用于抵御外来侵害的 免疫入侵系统，包括抵御入侵的病毒以及外源DNA。在现代基因工程应用领域与TALEN (transcription activator-like effector nuclease)以及ZFN(zinc_finger nuclease) 技术并列成为三大基因组编辑工具。相比较于TALEN及ZFN技术，CRI SPR-Cas9技术具有特异 性DNA识别能力，在第二类CRISPR系统中，Cas9核酸内切酶在sgRNA引导下切割双链DNA，造 成基因组双链断裂，利用细胞基因组修复的不稳定性产生非特异重组来产生修复错误(插 入或者缺失），从而可能产生移码突变而造成基因功能的丧失，实现基因敲除的目的。其 sgRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN识别模块的构建过程，且毒性远远低于ZFN 技术。但是CRISPR-Cas9技术也有上下文依赖性的缺点，目前只能应用于上游有PAM序列的 靶位点。
[0003] 多药耐药性(MDR)是指对一种药物具有耐药性的同时，对其他结构不同，作用靶点 不同的抗肿瘤药物也具有耐药性。多药耐药性是导致癌症药物治疗和肿瘤化疗失败的重要 原因之一。而多药耐药性的主要机制之一就是ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白的过 量表达，它们可由ATP水解供能来将抗癌药物栗出细胞外。它主要的家族成员包括六8081(卩-GP)、ABCC1(MRP1)和ABCG2(BCRP)等。细胞中ABCB1的高表达将会导致多药耐药的发生从而 使治疗失败，因此抑制或消除p-gp的表达能够有效的解决在肿瘤治疗中出现的多药耐药问 题。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术中某些高表达p-gp蛋白的细胞中出现多药耐药性等缺点与不 足，本发明的首要目的在于提供一种特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列，该sgRNA导向 序列可以用于敲除人ABCB1基因，进而抑制或消除p-gp的表达。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCB1基因的方法， 该方法采用CRISPR-Cas9技术对ABCB1基因进行编辑，使其正常序列发生缺失或者突变从而 达到敲除该基因的目的。
[0006] 本发明的再一目的在于提供上述特异靶向人ABCB1基因的SgRNA导向序列的应用。 [0007] 一种特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列，为Sgl或Sg2;其核苷酸序列分别为：
[0008] Sgl :5'-TTGGACTGTCAGCTGCTGTC-3'，位于基因 ABCB1 第八个外显子；
[0009] Sg2:5'-GACTGTCAGCTGCTGTCGTC-3'，位于基因 ABCB1 的第五个外显子；
[0010] 一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCB1基因的方法，包含如下步骤：
[0011] (1)在上述导向序列的5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸；同时根据导向序列获得 其对应的DNA互补链，并且在其5 '端加上AAAC得到反向寡核苷酸;分别合成上述正向寡核苷 酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成双链；
[0012] ⑵将步骤(1)制得的双链与Cas9载体连接，得到重组敲除表达载体；
[0013] (3)将步骤(2)制得的重组敲除表达载体与包装系统共转染包装细胞，然后收获病 毒纯化并浓缩，得到病毒颗粒；
[0014] (4)将步骤(3)制得的病毒颗粒感染细胞，筛选稳转细胞，得到成功敲除ABCB1基因 的细胞；
[0015] 步骤(2)中所述的Cas9载体优选为lentiCRISPRv2载体；
[0016]步骤(3)中所述的包装细胞优选为293T细胞；
[0017]步骤(3)中所述的包装系统中的包装载体优选为pMD2.G和psPAX2;
[0018] 步骤(4)中所述的细胞优选为肿瘤多药耐药性细胞；
[0019] 步骤(4)中所述的细胞进一步优选为HCT-8/V或KBV200;
[0020]所述的特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列在制备抗肿瘤多药耐药性药物中 的应用；
[0021]所述的肿瘤优选为人口腔鳞癌或人结直肠癌；
[0022]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0023] (1)为了最大限度避免脱靶现象的发生，选择使用两条sgRNA，即位于ABCB1基因两 个不同位置。利用lentiCRISPRv2载体将sgRNA以及CRISPR系统引入目标细胞中，Cas9蛋白 会在sgRNA的引导下找到与其匹配的DNA序列，进行剪切。
[0024] (2)载体中含有Puromycin抗性基因，利用Puromycin对细胞进行筛选，未转入 lentiCRISPRv2载体的细胞将在筛选过程中被淘汰。
[0025] (3)本发明提供的特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列，可通过CRISPR-Cas9系 统敲除或编辑ABCB1基因，进而抑制或消除p-gp的表达能够有效的解决在肿瘤治疗中出现 的多药耐药问题。
【附图说明】
[0026]图1是特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列的序列及其位置示意图。
[0027]图2是应用本发明设计的sgRNA对高表达p-gp的细胞株进行编辑后抽提细胞基因 组后进行测序与野生型细胞进行对比的测序分析图。
[0028]图3是实施例2PCR产物测序结果的测序峰图。
[0029]图4是成功敲除ABCB1基因的细胞株的p-gp蛋白表达量的western blot结果分析 图。
[0030] 图5是Doxorubicin、Vincristine和Ci splat in处理后，成功敲除ABCB1基因的细胞 株的细胞活性结果分析图。
[0031]图6是应用本发明设计的sgRNA对高表达p-gp的细胞株进行编辑后的药物积累实 验结果结果分析图。
[0032]图7是实施例3药物积累实验的流式结果分析图。
[0033]图8是实施例3药物积累实验流式结果的量化处理分析图。
【具体实施方式】
[0034]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0035] 实施例中所使用的细胞株均购自六了0：，161^丨0?13?1^2载体购自六(1(^6116，内切酶 BsmBI 购自 Biolabs，Polyetherimide(PEI)购自 Ploysciences，Puromycin 和 Polybreen 购自 Sigma；
[0036] 实施例1
[0037] (l)sgRNA 设计
[0038] 根据人ABCB1基因的基因组序列（gene ID:5343)，设计2个靶向人ABCB1基因的 sgRNAdOnt的寡核苷酸sgRNA导向序列为：Sgl: 5 ' -TTGGACTGTCAGCTGCTGTC-3 '（位于基因 ABCB1第八个外显子)和Sg2: 5 ' -GACTGTCAGCTGCTGTCGTC-3 '（位于基因 ABCB1的第五个外显 子）（图1);在其5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸(Forward oligo);根据导向序列获得其 对应的DNA互补链，并且在其5'端加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分别合成 上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的Forward 〇1 igo和 Reverse oligo成对变性，退火;退火后可以形成连入表达载体lentiCRISPRv2载体的双链， 同时将设计好的gRNA靶点序列进行blast比对以排除非特异性的靶切位点，具体寡核苷酸 序列见表1。
[0039]表1 sgRNA导向序列的寡核苷酸序列
[0040]
[0041 ] (2)构建表达sgRNA的载体
[0042] 病毒载体lentiCRISPRv2载体有BsmB I酶切位点，用BsmB I酶切，其中，酶切体系 (2〇yL 体系）为：BsmB I ΙμΜΙΟΧΝΕ buffer 2yL;质粒 lyL;ddH20 ΙθμΜ 酶切条件为：37°C 酶切lh;
[0043] 将酶切后的载体1 ent i CRI SPRv2分别与步骤（1)制得的退火双链利用T4连接酶进 行连接，连接体系（10yL)为：退火双链（Sgl或 T4DNA Ligase Buffer lyL，T4DNA Ligase lyL，ddH20 4yL;连接条件为：16°C连接过夜；
[0044] 将连接产物转化感受态细胞stbl3,具体转化方法为：-80°C取出感受态细胞 stbl3，与冰上溶解;然后50yL感受态细胞中加入lyL的上述连接产物，混匀后冰浴30min; 42 °C水浴90s，过程中勿摇动;冰上冷却1~2min;然后加入800yL LB培养基，37°C摇床30min; 涂AMP+板（100yg/mL)培养过夜，挑取阳性克隆后37°C摇床过夜进行扩大培养，并用Hipure Plasmid Micro Kit C(Magen)抽提质粒并测序验证，得到表达sgRNA的载体 lentiCRISPRv2-hABCBl-Sgl (导向序列为 Sgl)和 lentiCRISPRv2-hABCBl-Sg2(导向序列为 Sg2) (hABCBl表示为人基因 ABCB1)。
[0045] 实施例2
[0046] (1)核心质粒与包装质粒pMD2. G和psPAX2共转染至293T细胞中
[0047] 培养293T细胞，待293T细胞的汇集率达到50%~60%，种板后12~18h为最佳转染 时间；转染前更换新鲜培养液，60mm小皿中加入3mL培养基;转染时质粒的使用量为核心质 粒（实施例 1 制得的lentiCRISPRv2-hABCBl-Sgl或lentiCRISPRv2-hABCBl-Sg 2,另取 lentiCRISPRv2空载体作为对照）4yg、psPAX2 3yg、pMD2.G lyg、PEI 24yL，补充DMEM至总体 积为200yL，加入顺序分别为DMEM、PEI和质粒DNA(核心质粒、pMD2.G和psPAX2);然后室温静 止30min，使PEI与质粒DNA充分聚合，聚合结束后将转染体系逐滴加入上述培养有293T细胞 的小皿中，轻轻摇匀后放入37°C5%C0 2培养箱中继续培养；
[0048] (2)病毒的收获与浓缩
[0049] 收集转染后2处、4811、7211、9611 2931'细胞的上清液，每次收取病毒后再补充31^新 鲜培养液于小皿中，先收获的病毒原液用封口膜封闭后可暂存4°C冰箱中；待病毒液全部收 集完成后l〇〇〇rpm离心5min，以去除细胞碎片，用0.45μπι滤膜过滤去除细胞碎片及其他杂 质；取过滤后的病毒原液于100kD超滤柱内，4°C，4000g离心30min，收集滤膜内剩余约300yL 病毒浓缩液，50yL每管分装于1.5mL EP管内，置-80°C可长期保存，避免反复冻融；
[0050] (3)包装病毒颗粒分别感染目的细胞株