盐芥耐低磷基因ThPHT1-1及重组载体及应用

文档序号:9682236阅读:810来源:国知局
盐芥耐低磷基因ThPHT1-1及重组载体及应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子生物学和生物技术领域,更加具体地说,涉及一种盐芥耐低磷基 因及应用。
【背景技术】
[0002] 磷是生物生长发育的重要营养元素之一,是蛋白质、核酸、脂类以及各种重要的小 分子的重要组成成分,在植物新陈代谢过程中扮演着十分重要的角色。然而,磷是一种不可 再生的资源,大部分土壤有效磷含量较低,难以满足植物生长的正常需求。据报道,世界上 至少有30%~40%的作物产量受到低磷胁迫的严重抑制(Runge-Metzger A.)。农业生产 上,主要通过施用磷肥来解决土壤磷缺乏问题,但是使用的磷肥很容易被土壤固定为作物 不易吸收的难溶性磷,难以完全满足作物对磷的需求。因此,提高植物对磷的吸收和利用 率,创制耐低磷作物品种,对于减少农业磷的施用量,维护生态安全,提高作物的产量等方 面具有重要意义。随着对植物低磷胁迫应答的分子机理研究不断深入,特别是以拟南芥为 研究对象,植物在低磷胁迫条件下的研究取得了突破性的进展。目前,对具有耐低磷性能的 基因的分离是当前利用基因工程方法进行耐低磷作物培育的首要任务。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种盐芥耐低磷基因。
[0004] 本发明的第二个目的是提供一种含盐芥耐低磷基因的重组载体。
[0005] 本发明的第三个目的是提供一种含上述重组载体的宿主细胞。
[0006] 本发明的第四个目的是提供一种盐芥耐低磷基因在提高植物耐低磷的应用。
[0007] 本发明的技术方案概述如下:
[0008] 一种盐芥耐低磷基因 ThPHTl-Ι,该基因是序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序 列。
[0009] 含上述一种盐芥耐低磷基因 ThPHTl-Ι的重组载体。
[0010] 含上述重组载体的宿主细胞。
[0011] 上述一种盐芥耐低磷基因 ThPHTl-Ι在提高植物耐低磷性能的应用。
[0012] 本发明的盐芥耐低磷基因 ThPHTl-Ι,从盐芥中获取并具有序列表中SEQ ID N0.1 所示的核苷酸序列,并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞,采用该基因转染的拟 南芥表现出对低磷胁迫的耐受力,说明本发明提供的耐低磷基因 ThPHTl-Ι在改良作物耐低 磷的能力方面,起着重要的作用。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明的盐芥耐低磷ThPHTl-Ι基因克隆电泳示意图。
[0014]图2是包含本发明的盐芥耐低磷的基因 ThPHTl-Ι的表达载体示意图。
[0015]图 3是pCAMBIA3301_ThPHTl-l 转化农杆菌C58PCR 筛选结果。
[0016] 图4是ThPHTl-1转基因拟南芥T3纯合体半定量PCR结果。
[0017]图5是ThPHTl-Ι转基因拟南芥T3纯合体耐低磷根系实验效果。
[0018]图6是ThPHTl-Ι转基因拟南芥耐低磷实验根系生长情况。
[0019] 本发明中涉及到的实验材料、所用试剂来源如下:
[0020] 盐芥:由中国科学院植物所李银心教授带领,采自北京大兴区盐渍化的农田边。 [0021 ] pJETl · 2:购自赛默飞公司http://www. thermofisher· com/cn/zh/home .html
[0022] pD0NR201:购自赛默飞公司http: //www. thermofisher · com/cn/zh/home .html
[0023] pCAMBIA3301:购自赛默飞公司http: //www. thermofisher · com/cn/zh/home .html
[0024] DH5a感受态细胞,反转录试剂盒:购自北京北京全式金生物技术有限公司, http://www.transgen.com.cn/shop.htmlo
[0025] 胶回收试剂盒:购自宝生物工程公司,http: //www · takara · com · cn/。
[0026] 农杆菌菌株C58:购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心,
[0027] http://biovector.blog.163.com。
[0028]本发明中涉及到的反应体系:
[0029] BP 反应:
[0030] attB-PCR lul
[0031] PDonr 201 0.5ul
[0032] 1XTE Buffer(PH8.0)to 4ul
[0033] LR 反应:
[0034] Entry clone(lOOng/ul) lul
[0035] Destination vector(150ng/ul) 0.5ul
[0036] 1XTE Buffer(PH8.0) 2.5ul
【具体实施方式】
[0037] 实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件以及手册中所述的条 件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0038]下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0039] 实施例1
[0040] -种盐芥耐低磷基因的获得
[0041] 首先,以采自农田边的盐芥为原料,利用基因克隆技术,获取本发明的盐芥耐低磷 ThPHTl-Ι 基因。
[0042] 取生长了五周的新鲜盐芥植株,使用植物RNeasy Plant Mini Kit(Trans gene Code#EP101-0150rxns)提取total RNA,并且利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Trans gene Code#AE301_03100rxns)去除基因组DNA干扰,反转录出 cDNA〇
[0043] 在Phytozome和TAIR数据库中,找出拟南芥全部PHT1基因(9个),然后将这些 AtPHTs放入phytozome的盐芥数据库中进行检索。再利用获得的盐芥PHT1基因,在 phytozome再次检索,共找到14个盐芥PHT1基因。
[0044] 对ThPHTls基因进行了蛋白全序列对比,绘制了盐芥与拟南芥PHT1家族基因和系 统发生树,将与AtPHTl-1亲缘关系最近的盐芥Thhalv100 03186m命名为ThPHTl-1,并进行基 因克隆。本实验根据盐芥ThPHTl-l基因序列设计上游引物:PHT-F(SEQIDN0.2所示,5'-AATGCTTGGAATCAGGAGAGACA-S')和下游弓 | 物:PHT-R(SEQ ID N0.3 所示,5'-CACATC
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