盐藻的光调控基因表达载体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及光调控基因表达载体，具体地说，涉及一种适用于盐藻的光调控基因 表达载体。
【背景技术】
[0002] 基因表达系统主要分为组成型和诱导型两种，前一种用于基因表达是持续表达无 法进行调控的，而诱导型基因表达系统可以精确控制基因表达的开启/关闭。目前已有多种 化学物质诱导的基因表达系统，然而这些表达系统无法特异性地针对专一细胞或组织进行 调控，且存在不可避免的潜在毒性。Wang Xue等开发了一种光调控的基因表达系统-LighOn 系统（Wang X, Cheng X，Yang Y. Spat i ο temporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.Natrue Methods，2012,9(3):266_269)。该系统含 有两个表达载体，通过共转染哺乳动物细胞后利用可见光-蓝光激活目的基因的表达。这一 过程无需加入对环境有污染的诱导剂，同时也避免了潜在的毒性。更为重要的是，利用光可 以特异性地从时间和空间上调控基因的表达。这为重组基因的表达应用和基因治疗等方面 提供了一种非常有利的工具。
[0003][0004] 杜氏盐藻(Dunaliella salina，以下简称盐藻)是一种无细胞壁的单细胞真核绿 藻，其自身无毒无害且培养条件简单，便于进行遗传改造，因此用其作为转基因的宿主已被 开发作为一种新型的生物反应器用于重组蛋白的表达（Xue L，Pan W，Jiang G，Wang J.Transgenic Dunaliella salina as a bioceactor，美国专利号：7081567)。盐藻反应器 较之转基因动物、植物和细菌等反应器用于基因表达，具有成本低、高效低廉的特点，为大 规模生产外源性蛋白提供了优越的条件保证。
[0005] 近年来，盐藻作为生物反应器用于基因表达已取得了一些研究成果。冯书营等构 建了pU-Can-Bar载体在盐藻中表达了人canstatin基因并能在转化藻株中稳定遗传；用玻 璃珠转化法将质粒pBI221-bar转入盐藻细胞中，实现了外源报告基因 GUS的有效表达。李杰 等构建了盐藻表达载体DCAl-bar(D-B)，在内源性双拷贝碳酸酐酶启动子DCA1启动子驱动 下，报告基因 bar的表达强度明显高于在外源性启动子驱动下bar的表达。这些研究工作表 明，盐藻能够作为宿主用于外源基因的表达。
[0006] 但是，外源基因的表达效率不高，且无法对表达进行调控等问题仍是制约盐藻作 为宿主用于外源基因高效表达的主要瓶颈。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种适用于盐藻的光调控 基因表达载体。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0009] 第一方面，本发明提供一种用于盐藻的光调控基因表达载体，所述载体包括两个 基因表达盒：
[0010] 1)光敏转录因子GAVP0表达盒:包括盐藻肌动蛋白启动子(GenBank NO.AF541875) 和光敏转录因子GAVP0;
[0011] 2)受光敏转录因子GAVP0调控的目的基因表达盒。
[0012]所述目的基因表达盒由5'UAS转录元件驱动目的基因的表达。
[0013] 其中，所述光敏转录因子GAVP0来自pGAVPO质粒，所述pGAVPO质粒由华东理工大学 杨弋教授惠赠。
[0014] 所述光敏转录因子GAVP0的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015] 所述5'UAS转录元件的核苷酸序列如SEQIDNO·2所示。
[0016] 更为具体的，为了更好的实现光调控目的基因表达的功能，所述载体包括依次连 接的光敏转录因子GAVP0-盐藻肌动蛋白启动子-5'UAS转录元件-目的基因。
[0017] 进一步地，所述光调控基因表达载体的制备方法包括如下步骤：
[0018] S1、扩增光敏转录因子GAVP0表达盒：
[0019] S11、以盐藻肌动蛋白（actin)启动子(NO.AF541875)序列为模板，扩增启动子序列 并回收纯化；以pGAVPO质粒为模板，扩增GAVP0序列(含有SV40 polyA)并回收纯化；
[0020] S12、以S11获得的两段序列为模板，利用PCR扩增获得含有盐藻肌动蛋白启动子序 列和光敏转录因子GAVP0的光敏转录因子GAVP0表达盒；
[0021] S2、构建中间载体：
[0022]将pU5_Cre载体酶切成线性pU5_Cre载体片段后，与目的基因进行连接，获得中间 载体；
[0023] S3、构建光调控基因表达载体：
[0024] 将中间载体酶切成线性中间载体后，与S12获得的光敏转录因子GAVP0表达盒进行 连接，获得光调控基因表达载体。
[0025] 其中，pU5_Cre载体由华东理工大学杨弋教授惠赠。
[0026] 更进一步地，S2具体为：在目的基因的两端引入Nhe I和Bam!H酶切位点，并使用 Nhe I和BamH I对pU5-Cre载体进行双酶切，回收纯化酶切后获得的线性pU5-Cre载体片段， 与引入酶切位点的目的基因进行连接、转化、筛选重组子并提取质粒，进行酶切鉴定和测序 验证是否成功构建中间载体。
[0027] 更进一步地，S3具体为:在GAVP0表达盒基因的两端引入Not I和Nru頂每切位点， 并使用Not I和Nru I对中间载体进行双酶切，回收纯化酶切后的GAVP0表达盒基因 DNA片段 和线性中间载体，进行连接、转化、筛选重组子并提取质粒，通过酶切鉴定和测序验证是否 成功构建光调控基因表达载体。
[0028]可选的，将GAVP0表达盒基因片段回收纯化后连接到pUC57载体上，并在基因片段 的两端引入Not I和Nru I酶切位点，使用Not I和Nru I对中间载体和pUC57克隆载体进行 双酶切，回收纯化酶切后的GAVP0表达盒基因 DNA片段和线性中间载体，进行连接、转化、筛 选重组子并提取质粒，通过酶切鉴定和测序验证是否成功构建光调控基因表达载体。
[0029]其中，pUC57载体为本领域常规质粒，可购自Biovector中国质粒载体菌株细胞株 基因保藏中心。
[0030] 为了清晰且直观地验证上述重组表达载体中的目的基因可受光调控，在本发明的
【具体实施方式】中，所述目的基因为绿色荧光蛋白基因（EGFP)，该基因为本领域技术人员常 用基因，可由PEGFP-C1载体酶切得到，也可通过其他本领域常规技术手段获得，本发明不作 限制。
[0031] 第二方面，本发明提供了含有所述光调控基因表达载体的盐藻，导入有本发明前 述光调控基因表达载体的盐藻均在本发明的保护范围之内。
[0032] 第三方面，本发明提供了所述光调控基因表达载体在盐藻中通过光调控表达目的 基因的应用。
[0033]具体为，将所述光调控基因表达载体通过玻璃珠法介导导入盐藻细胞中，转化的 盐藻细胞可通过蓝光照射调控实现目的基因表达的开启和关闭。
[0034]在本发明的【具体实施方式】中，当目的基因为绿色荧光蛋白基因（EGFP)时，转染该 光调控基因表达载体的盐藻细胞，在经过蓝光照射后，倒置荧光显微镜下观察目的基因 EGFP表达情况。结果显示：蓝光照射可调控目的基因表达的开启和关闭。无光暗培养条件 下，镜下未见目的基因 EGFP的表达，蓝光照射后，镜下可见目的基因 EGFP在盐藻细胞中的高 效和稳定表达。
[0035]所述蓝光照射是使用含有180个小灯珠的LED蓝光灯带(460-470nm)在转化盐藻细 胞培养板下方进行连续光照，光照强度约为〇.8W/m2,即可调控目的基因的表达。
[0036] 本发明的有益效果在于：
[0037] 本发明所述的光调控基因表达载体在盐藻中的表达快速高效稳定、易于控制；盐 藻培养条件简单可进行露天大规模培养，目的蛋白生产成本低;盐藻本身营养丰富无细胞 壁容易进行目的蛋白的分离纯化;盐藻为真核细胞用于目的蛋白表达不需要进行翻译后加 工修饰即有生物活性。
[0038] 本发明提供了一种适用于盐藻的光调控基因表达载体。可通过蓝光有效调控目的 基因的表达，且表达效率高。这为盐藻作为生物反应器的开发利用提供了一种新的途径。
【附图说明】
[0039]图1为盐藻光调控表达载体pTODSJl构建策略；
[0040]图2为PCR扩增获得的GAVP0表达盒基因 DNA片段连接到pUC57克隆载体上酶切鉴定 结果:M，DNA Marker; 1为重组质粒;2为重组质粒用Not I和Spe I双酶切获得线性载体和盐 藻肌动蛋白启动子DNA片段(约730bp);
[0041 ]图3为构建的中间载体PU5-EGFP图谱示意图；
[0042]图4为构建的中间载体pU5-EGFP酶切鉴定结果，其中：1为重组质粒;2为重组质粒 用Nhe I和BamH I双酶切获得线性载体和EGFP的DNA片段(约800bp);M，DNA Marker;
[0043]图5为构建的盐藻光调控表达载体pTODSJl图谱示意图；
[0044]图6为盐藻光调控表达载体pU5DSJl酶切鉴定结果，其中：A为Not I+Sac I双酶切 鉴定结果，1为重组质粒酶切结果，2为重组质粒;B为BamH頂每切鉴定结果，3为重组质粒，4 为重组质粒酶切结果;M，DNA Marker;
[0045]图7为玻璃珠法导入表达载体pU5DSJl的盐藻转化株中目的基因 EGFP在暗培养和 蓝光照射后的表达结果。
[0046] A组为正常培养盐藻细胞观察结果，其中：A1为蓝光激发绿色荧光结果，A2为绿光 激发红色荧光结果，A3为正常光学显微镜下观察盐藻细胞；