乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导入植物细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物活性分子技术领域，涉及一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导入植物细胞的方法。
【背景技术】
[0002]生物活性分子导入技术在将酸性生物活性分子导入植物细胞这一方面，仍受到高效性、经济性和操作简易性等方面的限制，仍是对更广泛的植物物种进行活体细胞实时检测技术的瓶颈之一。相关研究曾报道，研究人员利用多孔硅纳米颗粒等材料将DNA分子导入植物原生质体中。然而，制备原生质体时，不仅操作繁琐、得率较低，得到的原生质体非常脆弱，极易破裂。因此，研究者们一直在探索一种能够将生物活性分子直接导入完整活体植物细胞的理想载体。
[0003]作为一种新型的生物活性分子载体，无机纳米材料正以其操作简单，适用广泛等优势受到研究者们的重视。其中，类水滑石纳米片(layered double hydroxide，LDH)相对于其他纳米材料而言，具有合成方法简单，原材料容易获得的优势。特别是还能通过对其片层结构表面进行功能基团的特异性修饰，进一步开发其应用潜力。
[0004]因此，本研究首次借助无机纳米材料乳酸根插层的类水滑石开发了一种将生物活性分子导入完整活体植物细胞的技术，这不仅能为基础生物学研究提供有力的工具，也将在多种作物和林业经济树种的基因改造和遗传育种方面具有重大意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导入植物细胞的方法，解决了现有技术难以将生物活性分子导入完整活体植物细胞中的问题。
[0006]本发明所采用的技术方案是，一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导入植物细胞的方法，按照以下步骤进行:
[0007]步骤1，合成乳酸根插层的类水滑石纳米材料MgAl-lactateLDH，在水中剥离获得二维纳米片LDH-lactate-NS;
[0008]步骤2，对LDH-lactate-NS进行XRD等表征分析鉴定；
[0009]步骤3，用含有不同浓度LDH-lactate-NS的缓冲液处理BY-2细胞和拟南芥，获得其负载生物活性分子导入植物细胞的安全浓度；
[0010]步骤4，将生物活性分子和LDH-lactate-NS以不同的质量比进行偶联；
[0011 ]步骤5，将二维纳米片-生物活性分子复合物与植物细胞共孵育，把生物活性分子导入植物细胞中。
[0012]进一步的，所述步骤1具体按照以下步骤进行:将镁/铝摩尔比为0.5:1-6:1的镁铝乳酸盐于125mL双蒸水中在30-100°C条件下溶解配制成溶液A置于分液漏斗中；另将大于等于铝的摩尔量的L-乳酸溶于25mL双蒸水中，配制成溶液B置于三颈圆底烧瓶中；在室温下快速搅拌将溶液A逐滴滴入溶液B中，滴定过程中用氢氧化钠溶液控制其pH体系，维持pH值为8-12；待滴定完毕后，继续剧烈搅拌并陈化5-48h，得到乳白色混合物，用双蒸水通过离心方法反复洗涤直至上清液变浑浊；将离心后的样品分为两份，一份置于真空干燥箱里室温干燥，干燥后研磨，所得粉末为MgAl-lactate LDH;另一份置于一定量的双蒸水中，剧烈搅拌直至没有沉淀变为透明状得到悬浊液C，悬浊液C的浓度由干燥后MgAl-lactate LDH质量和双蒸水的含量计算得出，记为LDH-lactate-NS，全过程在N2保护下进行。
[0013]进一步的，所述步骤2具体按照以下步骤进行:将剥离的LDH-lactate-NS滴在铜网上进行TEM(透射电子显微镜)成像，并烘干LDH-lactate-NS进行SEM(扫描电子显微镜)成像，采用凝胶法将LDH-lactate-NS置于托盘获得XRD特征谱，并用激光照射LDH-lactate-NS胶体检测丁达尔现象。
[00M] 进一步的，所述步骤4中，LDH-lactate-NS:带负电荷的生物活性分子DNA(脱氧核糖核酸)质量比为3:1时，LDH-lactate-NS:带负电荷的生物活性分子FITC(异硫氰酸荧光素)质量比为5:1时，可完全吸附。
[0015]进一步的，所述步骤5具体按照以下步骤进行:将LDH-lactate-NS的浓度控制在100ug/ml以下作为工作浓度，以DNA: LDH-lactate-NS质量比1: 3以上，以FITC:LDH-lactate-NS质量比1:5以上，孵育时间为lh，即将生物活性分子导入植物细胞中。
[0016]本发明的有益效果是:首次使用水中剥离的二维纳米片(LDH-lactate-NS)通过偶联生物活性分子获得纳米片-生物活性分子复合物，以最优吸附比和孵育时间与植物细胞共孵育将生物活性分子导入完整的活体植物细胞中。(1)在水中剥离获得了LDH-lactate-NS 二维纳米片 ，保证了溶剂对细胞无毒， 克服了现有的生物活性分子载体只能溶于 DMS0/甲醇等有毒溶剂中；(2)通过试验探索，利用LDH-lactate-NS二维纳米片吸附生物活性分子的特性，弥补了现有的生物活性分子载体吸附生物活性分子时间较长的缺点，大大缩短了试验时间，为活体实时检测提供了更加便利和快捷的方法；(3)通过优化对生物活性分子的负载和导入生物活性分子至活体细胞的条件，可以借助LDH-lactate-NS 二维纳米片高效吸附生物活性分子并有效导入完整活体植物细胞中，超越了现有生物活性分子载体的功能极限。
【附图说明】
[0017]图1 是LDH-lactate-NS表征:其中，ASLDH-lactate-NS的XRD表征；B为LDH-lactate-NS 的 FE-SEM 表征；C为LDH-lactate-NS 的丁达尔现象；D为LDH-lactate-NS 的 HR-TEM表征。
[0018]图2是PI染色不同浓度LDH-lactate-NS处理的BY-2细胞:其中，A_C为PI染色25yg/ml LDH-lactate-NS处理的BY-2细胞;D-F为PI染色50yg/ml LDH-lactate-NS处理的BY-2细胞;G-1为PI染色 100yg/ml LDH-lactate-NS处理的BY-2细胞;J-L为PI染色300yg/ml LDH-lactate-NS处理的BY-2细胞。标尺长度为ΙΟΟμπι。
[0019]图3是含不同浓度LDH-lactate-NS培养基上的幼苗根长、胚轴长度:其中，A为拟南芥幼苗的根长;B为拟南芥幼苗的胚轴长度。**表示P < 0.01，***表示P <0.001o
[0020]图4是LDH-lactate-NS对DNA分子的吸附能力。[0021 ]图 5是 Zeta-potential 数据。
[0022]图6是LDH-lactate-NS负载FITC导入BY-2细胞:A为明场;B为荧光图；C为高倍镜下的DIC图；D为高倍镜下的荧光图；E为C和D的叠加图。标尺长度分别为100μπι(Α和B)和20μπι(C、D和Ε)。
[0023]图7是LDH-lactate-NS负载ssDNA-FITC导入BY-2细胞:A为背景荧光图；B为LDH-lactate-NS负载ssDNA-FITC导入BY-2细胞后的荧光图；C为对A图荧光场的三维成像;D为对B图荧光场的三维成像;E为A和B图荧光场的灰度值;F为对应B图细胞的明场。标尺长度为30
μ??ο
[0024]图8是LDH-lactate-NS负载FITC导入拟南芥细胞，标尺长度为30μπι。
[0025]图9是LDH-lactate-NS负载ssDNA-FITC导入拟南芥细胞，标尺长度为30μπι。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0027]本发明一种乳酸根插层的类水滑石超薄纳米片负载生物活性分子导入植物细胞的方法，按照以下步骤进行:
[0028]步骤1，合成乳酸根插层的类水滑石(MgAl-lactateLDH)纳米材料，在水中剥离获得二维纳米片(LDH-lactate-NS):
[0029]将镁/铝摩尔比为0.5:1-6:1的镁铝乳酸盐于125mL双蒸水中在30_100°C条件下溶解配制成溶液A置于分液漏斗中；另将大于等于铝的摩尔量的L-乳酸溶于25mL双蒸水中，配制成溶液B置于三口圆底烧瓶中；在室温下快速搅拌将溶液A逐滴滴入溶液B中，滴定过程中用氢氧化钠溶液控制其pH体系，维持pH值为8-12;待滴定完毕后，继续剧烈搅拌并陈化5-48h，得到乳白色混合物，用双蒸水通过离心方法反复洗涤直至上清液变浑浊;将离心后的样品分为两份，一份置于真空干燥箱里室温干燥，干燥后研磨，所得粉末为MgAl-lactateLDH;另一份置于一定量的双蒸水中，剧烈搅拌直至没有沉淀变为透明状得到悬浊液C，悬浊液