一种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程菌技术领域，尤其是通过对微生物利用糖类发酵合成尸胺的 代谢途径中的关键调控位点进彳丁改造，从而有效提尚尸胺的广量的一种提尚微生物利用糖 类发酵生产尸胺的方法。
【背景技术】
[0002] 尸胺(Cadaverine)是一种多胺，即1，5-戊二胺（简称戊二胺），在生物体内由赖氨 酸脱羧生成，是广泛存在于生物体中的具有生物活性的含氮碱，但也作为一种肉毒胺存在 于腐败物中。尸胺是合成新型材料聚酰胺_54(由尸胺和琥珀酸缩合而成)和聚酰胺_56(由 尸胺和乙二酸缩合而成）的重要原料，具有重要的工业用途。
[0003] 目前合成尸胺的方法有化学合成法和酶转化法。化学合成法条件苛刻、污染环境， 酶转化法过程复杂、成本较高。利用基因工程技术构造代谢工程菌来直接规模化制备人类 所需产品是最经济、环保和最有前途的方法，是代谢工程研究的方向和热点。
[0004] 微生物发酵法生产尸胺就是微生物利用糖类进行发酵，通过代谢直接大量合成尸 胺，这种方法简单、经济、环保和高效。虽然大肠杆菌、尸杆菌、蜂房哈夫尼菌等可以直接合 成尸胺，也对尸胺合成调节进行了广泛研究，但尸胺的产量有待提高。
[0005] JP2002223770和一些论文表明通过将赖氨酸脱羧酶基因和/或赖氨酸-尸胺反向 转运蛋白基因 cadB引入到谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌来提高尸胺生产。CN200780006903.9公 开了尸胺合成途径中的一系列基因的敲除、抑制或增强，但是这些文献和专利都没有发现 敲除或弱化赖氨酸转运蛋白基因 lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi可以有效提高尸胺的 产量。
[0006] 因此，通过对比，本发明专利申请与上述公开文献存在本质的不同。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过发现新的能提高微生 物发酵糖类生产尸胺的调控位点，并改变这些位点基因的表达方式来提高尸胺产量的一种 提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法。
[0008] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0009] -种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法，通过对微生物合成尸胺的代谢途 径中的关键调控位点进行改造。
[0010]而且，所述关键调控位点为赖氨酸转运蛋白基因 lysE位点和6-磷酸葡萄糖异构酶 基因 pgi位点，或者调控上述关键调控位点基因表达的这两个基因的调控位点。
[0011]而且，敲除赖氨酸转运蛋白基因 lysE和/或6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi，和/或 者，通过改变它们的启动子、核糖体结合位点或进行基因突变来弱化它们的表达或弱化酶 的活性。
[0012]而且，所述微生物为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、蜂房哈夫尼或它们的重组菌株。
[0013] 而且，改造的具体步骤如下：
[0014] 通过将肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA克隆至谷氨酸棒杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸 羧激酶基因 pepck位点上，构建出产尸胺谷氨酸棒杆菌重组菌CAD1;
[0015] 将重组菌株CAD1的赖氨酸转运蛋白基因 lysE敲除，构建出尸胺产量提高了的谷氨 酸棒杆菌重组菌CAD2;
[0016] 将重组菌株CAD2的6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi敲除，构建出尸胺产量提高了的 谷氨酸棒杆菌重组菌CAD3。
[0017] 本发明取得的优点和积极效果：
[0018] 1、本方法通过对微生物利用糖类发酵合成尸胺的代谢途径进行改造，通过改造产 尸胺的微生物利用糖类发酵生产尸胺的调控位点，这些调控位点包括赖氨酸转运蛋白基因 lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi，通过敲除和/或弱化赖氨酸转运蛋白基因 lysE和6-磷 酸葡萄糖异构酶基因 pgi，可以有效提高尸胺的产量，从而提高糖类的利用率，降低生产成 本。
[0019] 2、本方法将赖氨酸转运蛋白基因 lysE敲除并将赖氨酸-戊二胺反向转运蛋白基因 cadB整合至lysE基因位点，阻止它们的表达，来抑制赖氨酸的分泌，同时加速将戊二胺转运 至胞外；将乙酰转移酶基因 Ncgll469敲出可以防止尸胺的降解;将6-磷酸葡萄糖异构酶基 因 pgi敲除，切断糖代谢的糖酵解途径，从而有效提高尸胺的产量。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明中不同重组菌株尸胺的产量图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0022] 本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域内的常规方法;本发明中所使 用的试剂，如无特殊说明，均为本领域内的常用试剂。
[0023] 本发明所涉及的技术术语的含义：
[0024] "尸胺" BP1，5-戊二胺。
[0025] "重组菌株"指非野生型菌株，包括通过诱变育种、基因工程育种或其它任何方法 获得的非野生型菌株。
[0026] "调控位点"指赖氨酸转运蛋白基因 lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi及其所在 位置以及所有调控这些基因表达的其它基因及其所在位置。
[0027] "基因敲除"指敲除或突变目的基因、目的基因的核糖体结合位点、目的基因的启 动子或目的基因的调控基因，使目的基因不能表达或者不能表达成有活性的蛋白质(酶）。
[0028] "基因弱化"指目的基因的表达水平或酶活性低于微生物在操作前的表达水平或 酶活性。包括通过改变它们的启动子、核糖体结合位点或进行基因突变及其其它任何方法 来弱化它们的表达或弱化酶的活性。
[0029 ]本发明所运用的技术手段：
[0030]本发明的基因序列包括赖氨酸脱羧酶基因、赖氨酸-尸胺蛋白反向转运基因、赖氨 酸转运蛋白基因 lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi序列都是公开的序列。质粒 pKISmobsacB、分子操作技术、微生物培养技术及尸胺的检测等，对于本领域的技术人员而 目都是公知的。
[0031 ] 实施例1
[0032] -种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法，所述方法中对于微生物合成尸胺 的关键调控位点进行改造，例如，所述关键调控位点为赖氨酸转运蛋白基因 lysE位点和/或 6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi位点，或者，所述关键调控位点为调控上述基因表达的调控位 点。
[0033] 较优地，所述对于微生物合成尸胺的关键调控位点进行改造为:敲除赖氨酸转运 蛋白基因 lysE和/或6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi，和/或者，通过改变它们的启动子、核糖 体结合位点或进行基因突变来弱化它们的表达或弱化酶的活性。
[0034] 较优地，所述微生物为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、蜂房哈夫尼或它们的重组菌株。
[0035] 上述提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法，具体步骤如下：
[0036] ⑴产尸胺谷氨酸棒杆菌重组菌CAD1的构建
[0037] 根据NCBI提供的大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基 因 pepck附近的序列设计引物，分别扩增出cadA和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因 pepck的 上、下游同源臂序列pckL和pckR，然后以cadA、pckL和pckR为模板，通过重叠延伸PCR将这 三个片段链接成pckL-cadA-pckR片段，这个片段通过Hind III和BamH I酶切后克隆到 pK18mobsacB的相同酶切位点之间，构建出质粒pK18-pckL_cadA-pckR。用这个质粒转化谷 氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032,并通过菌落PCR筛选出阳性克隆。把筛选出的阳性克 隆接种到至蔗糖平板(10%蔗糖的LB培养基），长出菌落后分别接种到含有卡那霉素和不含 有卡那霉素的LB平板上。含有卡那霉素的LB平板上不生长而不含有卡那霉素的LB平板上生 长的菌落即为可能的cadA基因插入到pepck基因位点的重组菌株，然后再进行菌落PCR验 证，若扩增出目的片段大小的条带，即为产尸胺谷氨酸棒杆菌重组菌CAD1。
[0038] 构建重组菌CAD1所设计的引物序列如表1:
[0039] 表1为本发明构建重组菌CAD1所需引物表
[0040]
[0041 ]⑵敲除赖氨酸转运蛋白基因