源自绞股蓝的新型葡萄糖基转移酶及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对利用糖苷键连接在PPD (原人参萜二醇）类或PPT (原人参萜三 醇）类的人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖具有糖转移活性的新颖的UDP-糖基转移酶（尿 苷二磷酸葡萄糖基转移酶）蛋白质及其用途。
【背景技术】
[0002] 人参阜苷作为被糖基化的达玛烧（dammarene)类的四环三砲（tetracyclic triterpene)，可根据糖苷配基（aglycone)的结构而分为原人参二醇类（原人参砲二 醇-type，PH)类）人参皂苷、原人参三醇类（原人参萜三醇-type，PPT类）人参皂苷、及 齐墩果酸类（oleanolic acid类）人参皂苷三类。这三类再根据通过糖苷键附着到化合 物结构中环的第3位碳、第6位碳及第20位碳的位置上的糖部分体（糖苷配基）（sugar moieties(aglycones))的位置及数量而分类。另外，PH)及PPT具有不同的羟基化形态 (hydroxylation pattern)。PH)在第3位、第12位及第20位碳的位置上具有-OH基，相反 地，PPT在第3位、第6位、第12位及第20位碳的位置上具有-OH基。所述PH)及PPT可 利用葡萄糖及其他糖进行糖基化而转化成各种人参皂苷。pro被糖基化的形态的人参皂苷 有人参皂苷Rbi、Rd、F2、Rg 3、Rh2、CK (化合物K)、Rb2、Rc、C-MC (化合物MC)及C-Y (化合物 Y)等，PPT被糖基化的形态的人参皂苷有人参皂苷Rgl、％、Fl、Rf、Re及Rg2等。
[0003] 另一方面，只知一部分人参皂苷生物合成路径。已知在通过IPP异构酶（ΙΡΙ)、 GPP合成酶（GPS)、FPP合成酶（FPS)、角鲨烯合成酶（SS)及角鲨烯环氧酶（SE)的作用发生 异戊稀焦磷酸（isopentenyl diphosphate)及 DMADP(dimethylallyldiphosphate，二甲基 丙烯基焦磷酸）的一系列的缩合反应而合成氧藍稀（oxidosqualene)前，所述生物合成路 径与其他三砲路径一同共享其路径的一部分（Ajikumar et al. Science, 330, 70-74. 2010 ; Ro et al. Nature, 440, 940-943,2006 ;Sun et al. BMC genomics, 11,262,2010)。氧藍 稀由作为三砲环化酶（triterpenecyclase)的 DS(dammarenediol_II synthase，达玛稀 二醇-II合成酶）环化成达玛烧二醇-II (dammarenediol-II)。达玛烧二醇-II在第 3位及第20位碳上具有羟基，通过作为p450酶的PPDS(原人参萜二醇synthase)在第 12位碳上羟基化（hydroxylation)而可转化为PPD。PPDS通过另一作为p450蛋白质的 PPTS(protopanaxatirol synthase)在第6位碳上实现羟基化而可转化为PPT。PFO可在第 3位及/或第20位碳上糖基化而转化成各种PH)类人参皂苷，PPT可在第6位及/或第20 位碳上糖基化而转化成各种PPT类人参皂苷。
[0004] UDP(Uridine diphosphate，尿苷二磷酸）-糖基转移酶（UGT， UDP-glycosyltransferase)是从UDP-糖向诸如荷尔蒙及2次代谢物质的各种代谢物质 转移糖的酶。通常，UGT为了提高代谢物质的溶解性、稳定性、存储性、生物体活性及生物 学上的利用可能性，在生物合成路径内在最终阶段发挥作用。从植物代谢物质的惊人的 多样性可知，各植物的基因组大致拥有数百个不同的UGT。例如，在拟南芥（Arabidopsis thaliana)植物模型中，包含属于以氨基酸为基础而分类的14个组（组A至组N)中的107 个UGTs。但是，作为人参皂苷生物合成酶，报告有DS、PPDS及PPTS，但对于干预人参皂苷生 物合成的UGT却几乎一无所知，因此为了生成特定的人参皂苷，需要查明以人参皂苷为基 质的UGT。
[0005] 另外，不同的UGT对糖供体（sugar donor)及糖受体（sugar acceptor)均显 示出基质特异性。例如，UGT78D2从UDP-葡萄糖向黄酮醇（kaempferol、quercetin)及 花青苷（caynidin)的第3位碳转移葡萄糖，分别生成黄酮醇-3-0-葡糖苷（flavonol 3-〇-glucosides)及花青素-3-0-葡糖苷（cyanidin 3-〇-glucoside)。为了在 in vivo 中保持稳定性及存储性，则必需如上所述的糖基化。相反地，UGT89C1将UDP-鼠李糖 (rhanmnose)的鼠李糖转移到黄酮醇-3-0-葡糖苷（flavonol-3-〇-glucosides)的第7位 碳而生成黄酬醇 _3_〇-葡糖昔-7-0-鼠李糖昔（flavonol-3-〇-glucoside-7-〇_rhamnosi de)。在所述UGT89C1的情况下，已知未将UDP-葡萄糖及花青素-3-0-葡糖苷均用作基质， 由此显示出不同于UGT78D2的对UDP-糖及受体（acceptor)的不同的特异性。如上所述， 在不同种类的UGT的情况下，基质特异性及位置特异性会彼此不同，从而需要查明各UGT的 基质特异性及位置特异性。
[0006] 在这种背景下，本发明人等为了开发出具有基质特异性及位置特异性而可利用 在特定人参皂苷的生物合成中的新颖的UDP-糖基转移酶进行了锐意努力，结果查明了 具有从绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum)向人参阜苷转移糖的活性的新颖的糖基转 移酶即GpUGT23,确认到所述GpUGT23对通过糖苷键而与PH)类及PPT类人参皂苷的第 20位碳连接的葡萄糖具有糖转移活性，且确认到可将所述GpUGT23用于诸如绞股蓝皂甙 (Gypeno6side)LXXV、绞股蓝阜戒（Gypenoside)XVII、Rbl、三七阜苷（Notoginsenoside)U、 三七阜苷（Notoginsenoside)R3或葡萄糖-Re(gluco-Re)的特定人参阜苷的生产中，从而 完成了本发明。
【发明内容】
[0007] [发明要解决的问题]
[0008] 本发明的一个目的在于提供一种制备在通过糖苷键而与第20位碳连接的葡萄糖 上转移有的糖的Pro或PPT类的人参皂苷的方法，其是利用对通过糖苷键而与PPD (原人参 萜二醇）类或PPT (原人参萜三醇）类的人参皂苷的第20位碳连接的葡萄糖具有糖转移活 性的UDP-糖基转移酶蛋白质、包含对所述蛋白质进行编码的多核苷酸的载体、导入有所述 载体的转化体或所述转化体的培养物来进行制备。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种用于向具有通过糖苷键而连接在第20位碳上的 葡萄糖的Pro类或PPT类的人参皂苷转移糖的组合物，其包含所述UDP-糖基转移酶蛋白 质、包含对所述蛋白质进行编码的多核苷酸的载体、导入有所述载体的转化体或所述转化 体的培养物作为有效成份。
[0010] 本发明的又一目的在于提供一种UDP-糖基转移酶蛋白质，其对通过糖苷键而连 接在所述Pro类或PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖具有选择性糖转移活性。
[0011] 本发明的又一目的在于提供一种转化体，其包含对所述蛋白质进行编码的多核苷 酸、包含所述多核苷酸的表达载体、包含所述表达载体。
[0012] [解决问题的技术手段]
[0013] 为了达成所述目的，作为本发明的一实施方式，提供一种制备通过糖苷键而连接 在第20位碳上的葡萄糖被糖基化而成的pro或PPT类的人参皂苷的方法，其是利用对通过 糖苷键而连接在PPD (原人参萜二醇）类或PPT (原人参萜三醇）类人参皂苷的第20位碳 上的葡萄糖具有糖转移活性的UDP-糖基转移酶蛋白质、包含对所述蛋白质进行编码的多 核苷酸的载体、导入有所述载体的转化体或所述转化体的培养物来进行制备。
[0014] 在本发明中，术语"UDP (uridine diphosphate)-糖基转移酶"是具有从糖基供体 (glycosyl donor)向糖基受体分子（glycosyl acceptor molecule)转移（transfer)单 糖基的活性的酶，具体而言，是指将UDP-糖用作糖基供体的酶。在本发明中，所述UDP-糖 基转移酶可与"UGT"混合使用。对于所述人参皂苷UDP-糖基转移酶几乎一无所知，即使具 有UDP-糖基转移酶活性，其基质特异性及位置特异性也因酶的种类而异，因而需要个别地 查明是否为在人参阜苷（ginseng saponin)中特异地发挥作用的UDP-糖基转移酶。
[0015] 在本发明中，首次查明了可选择性地向通过糖苷键而连接在pro类人参皂苷 及PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖转移糖部分体的、源自绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum)的新颖的UDP-糖基转移酶。本发明中查明的UDP-糖基转移酶具有选择性 地向通过糖苷键而连接在PH)类人参皂苷或PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖转移 UDP-葡萄糖的糖部分体的活性。因此，本发明中查明的UDP-糖基转移酶并非特别限制于 此，但通过向利用糖苷键而连接