一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子标记技术护领域，尤其涉及一种天牛科幼虫不同家系的分子标记 方法。
【背景技术】
[0002] 天牛幼虫的分类研究主要集中在个体形态学领域，但由于幼虫分离鉴定资料极其 缺乏，许多种类的幼虫形态迄今尚未描述；不同地理分布的同种天牛幼虫，形态有一定差 异；亲缘关系较近的种类，形态非常相似，鉴定时容易混淆。因此，随着分子生物学的发展， 核酸序列分析（DNA sequenceanalysis)被越来越多地用于天牛幼虫的分子鉴定，在出入境 检验检疫工作中具有重要意义。
[0003] 线粒体DNA (mtDNA)分子量较小，遵循母系遗传，进化速率快，是分子分类学重要 的标记之一。其细胞色素氧化酶I、II (C0I、C0 II )在近缘种及种下阶元的分类鉴定以及 不同地理种群的遗传变异中应用较广。
[0004] 随着分子生物学技术的飞速发展，分子标记技术被广泛应用于昆虫种群间的亲 缘关系分析。C0I基因在昆虫近缘种及种下阶元的分类系统研究中应用较广。安榆林等 (2004)用mtDNA序列分析了光肩星天牛mtDNA的特点，得出mtDNA可用于天牛不同地理种 群及近缘种的的鉴定和系统遗传分析。张凯（2013)将Z i/?cWiiM?Pascoe的mtDNACOI序 列与来自幽天牛亚科、天牛亚科、沟腔天牛亚科的不同种天牛的mtDNACOI序列构建NJ系统 树，发现在进化关系上与天牛亚科最近。
[0005] DNA条形码技术通常是利用线粒体C0I5'端序列将物种鉴定到种水平的一种鉴 定方法（Hebert等，2003)。Hebert等（2003)对包括脊椎动物和无脊椎动物动物界的 C0I基因序列比较分析得出：除腔肠动物外，98%同属物种的C0I种间遗传距离差异平均为 11. 3%，不同属物种的C0I遗传距离差异更大。
【发明内容】
[0006] 发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种天牛科幼虫不 同家系的分子标记方法。本发明通过对口岸经常截获的天牛科C0I基因进行扩增，同网上 登录序列进行比较，分析其基因组成及变异，并构建系统发育树，研究其分类地位。以期在 实际工作中辅助天牛科幼虫分类鉴定，为形态学分类做补充，为进一步的研究奠定基础。
[0007] 技术方案：为了解决上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种天牛科幼虫不 同家系的分子标记方法，采用以下步骤实现： 1)选用两对特异性引物进行PCR反应，所述两对特异性引物为 上游引物 J173 :5' - TAACAGCACATGCTTTTGTA-3' 下游引物 J1331 :5' -GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3' ； 上游引物 J1718 :5' -GGAGGAITTGGAAATTGATTAGTTCC-3' 下游引物 N2191 :5' -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3' ； 2) 从待测不同家系的天牛个体及亲本，采用DNA提取法提取基因组DNA ; 3) 用步骤2)的基因组DNA为模板，步骤1)所选的两对引物分别进行两轮PCR扩增； 4) 对步骤3)的PCR产物用1.5 %琼脂糖电泳检测，溴化乙锭染色后紫外线下观察并拍 照电泳结果，剩余部分送上海金斯瑞有限公司纯化并测序； 5) 获得的DNA序列先提交到GenBank数据库中，然后利用BLAST工具进行相似性检 索，并确定片段方向；用GenDoc软件进行序列同源性比较；用MEGA5. 0软件，计算各物种间 的遗传距离，转换和颠换值及其比值，保守位点及变异位点等数值，用邻接法构建系统发育 树，根据个体间的遗传距离聚类结果，区分来自不同家系的个体。
[0008] 在步骤3)中，在进行PCR扩增时，PCR反应体系采用50 μ 1标准反应体系，其中含 有 10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ 1，2. 5 mmol/L 的 dNTPs 4 μ 1，ragDNA 聚合酶 0· 4 μ 1， cDNA模板2μ 1，上下游引物各1 μ 1，后加 ddH20补足5〇μ1。
[0009] 在步骤3)中，第一轮PCR反应的条件为：94 °C预变性3min ;94 °C变性30s，55°C 退火30s，72°C延伸lmin，循环35次，循环结束后再72 °C延伸10 min。
[0010] 在步骤3)中，第二轮PCR反应的条件为：94 °C预变性3min ;94 °C变性30s，47°C 退火30s，72°C延伸45s，循环35次，循环结束后再72 °C延伸10 min。
[0011] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明对33种天牛C0I基因的遗 传距离表明：该片段C0I基因在断眼天牛属3种天牛种间的遗传距离介于0. 052~0. 087 间；其余天牛种间的遗传距离介于〇. 〇75~0. 292间，不同属间遗传距离明显大于同属间遗 传距离，C0I基因完全符合DNA条形码有效性的检验标准，该片段可以较好的区分天牛的 不同属的不同种类，可用于天牛科的快速鉴定。
【附图说明】
[0012] 图1PCR方法特异性实验的电泳图；俄罗斯天牛幼虫扩增出了一条481bp的片段， 参见泳道1和泳道2,其他天牛均未扩增出片段，参见泳道； 图2a和图2b天牛C0I基因的遗传距尚； 图3天牛C0I序列构建NJ系统进化树。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实验例详细阐述本发明。
[0014] 实施例1 : 1、试验材料： 所用天牛标本均为江苏出入境检验检疫局各口岸昆虫实验室多年截获的标本。5种标 本来源和采集时间见表1。此外，选取Genbank登录的28种天牛C0I基因序列进行比对，见 表2。
[0015] 表1实验标本名称和来源 表2Genbank下载序列信息 2、基因组总DNA的提取 采用GenMag动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒：将酒精浸泡过的虫体，选择适当 大小的肌肉组织，无菌水清洗2-3次，浙干水分后，将组织进行研磨，加入适量的裂解液和 蛋白酶K，55 °C温浴，使得组织完全裂解。再加入磁珠和缓冲液，使DNA吸附到磁珠上，使用 Wash Buffer进行除杂，除杂完毕后，加入少量的Elution Buffer，将DNA溶解，得到基因组 DNA溶液，-20°C保存。
[0016] 3、C0I基因扩增及测序 PCR扩增采用巢式PCR，所用引物分别为： 第一轮：J173 :5, - TAACAGCACATGCTTTTGTA-3' J1331 :5' -GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3' 第二轮：J1718 :5' -GGAGGAITTGGAAATTGATTAGTTCC-3' N2191 :5' -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3'，均由上海金斯瑞有限公司合成。
[0017] PCR反应体系采用50μ 1标准反应体系，其中含有10XPCR Buffer (Mg2+)5 μ 1， dNTPs(2.5mmol/L)4 ylJai/DNA