一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法
【技术领域】
[00011 本发明涉及一种检测F0XH1基因 SNP位点rs750472基因型的方法。
【背景技术】
[0002]叉头框(F0X)基因家族作为一种转录因子，广泛存在于生物体中。该基因家族成员 功能各异，但它们都具有一个高度保守的叉头DNA结构域，该结构域包括由100多个氨基酸 组成的螺旋-转角-螺旋基序，3个α螺旋组成的核心区域和2个可与靶DNA分子相互作用的环 组成的翼状结构。该家族基因通过激活或抑制靶基因的转录和表达，对机体的发育、分化、 代谢等起关键的调节作用。所有的F0X基因的家族成员都可以通过DNA结构域结合DNA，其功 能涉及细胞分化状态的维持、组织特异性基因的表达、胚胎发育、细胞周期调控、糖类及脂 类代谢、细胞凋亡等多个生物学过程，并且其基因突变与发育畸形、肿瘤发生发展密切相 关。
[0003] 先天性心脏病(congenital heart diseases，CHDs)有很多种类型，通常将其分为 简单和复杂的先天性心脏病。简单的先天性心脏病有以下三种:室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)、房间隔缺损（atrial septal defect,ASD)、动脉导管未闭（patent ductus arteriosus, PDA)。复杂的先天性心脏病主要包括以下几种：法洛四联症 (tetralogy of Fallot，T0F)、肺动脉瓣狭窄（pulmonary stenosis，PS)、大动脉异位 (transposition of the great arteries，TGA)、主动脉缩窄（aortic stenosis,AS)、右 室双出口（double-outlet right ventricle，D0RV)，房室传导阻滞（atrioventricular block，AVB)等。其中室间隔缺损（以下简称为VSD)在新生儿CHDs患者中的发病率约为20%， 在儿童中约为30%，是所有CHDs患者中发病率最高的一种。VSD是指胚胎发育时期室间隔发 育不全，左右心室之间存在一直接开口，产生左向右分流。VSD可单独发生，形成单纯性室间 隔缺损，也可能是某种复杂心脏畸形的组成部分之一，形成非单纯性室间隔缺损。这种心脏 缺损会导致左心室的富氧血液流入右心室而非正常流入主动脉。甘肃省六地市2-19岁人群 调查结果表明CHDs总患病率为0.571 %，其中VSD占52.72%。尽管大多数VSD可通过手术方 式来纠正，但手术治疗会给患儿家庭和社会带来沉重的经济负担，而且VSD患者术后发生 心脏功能异常的机率较正常人大大增加。因此，寻找和检测VSD相关基因，用于产前诊断和 基因治疗，以最大可能地避免VSD患儿出生及纠正遗传缺陷，是当前心血管领域研究重点内 容。
[0004] 高分辨率溶解曲线(high resolution melting, HRM)分析技术是于2003年由美 国Utah大学Wittwer实验室提出的基于新型饱和突光染料LC Green发明而进行基因突变检 测的一项新技术。HRM分析原理是在常规聚合酶链式反应(PCR)后饱和荧光染枓与双链DNA 结合，当通过加热升温使DNA双链解离时，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，由于突 变、SNP位点双链碱基间不匹配会使双链DNA在此位点首先解开，通过实时监测升温过程中 的荧光强度，从荧光强度与时间轴曲线上就可以判断是否存在突变或SNP，而且不同位点、 杂合子与否、GC含量、扩增子长度等都会影响熔解曲线的峰形。因此，HRM分析能够有效区分 不同突变位点、SNP位点和拥有不同GC含量的扩增片段。
【发明内容】
[0005] 本申请人经研究发现:核转录因子F0XH1基因是DNA结合蛋白winged helix转录因 子家族的新成员，在VSD信号通路中起到重要的转录调节的作用。在不区分性别的情况下， 当FoxHl基因 SNP位点rs750472的基因型为GG或TG时，先天性心脏病易感性(VSD)增加。具体 实验如下： 选取573名来医院就诊的患者，其中对照组276人，VSD患者组为297人。对照组rs750472 位点的TT，GT，GG基因型频率分别为57.6%，35.9%及6.5%; VSD患者中相应基因型频率分别为 39.4%，45.5%及15.2%。!1，G等位基因频率在VSD病患组中分别为61.6%和38.4%;对照组相对 应的等位基因频率分为75.5%和24.5%，详见表1。
[0006] 表1对照组与VSD患者组的基因型频率及等位基因频率 由表1可知： 以野生等位基因 T做为参照，则G等位基因频率在病患组和对照组之间的差异性具有显 著的统计学意义，Ρ=〇· 005，0R=1.883( 1.210-2.931)。
[0007] 以野生基因型TT做为参照，GT基因型频率在病患组和对照组之间有差异性，P= 0.047，0R=1.853(1.006-3.412) AG基因型频率在病患组和对照组之间的差异具有显著的 统计学意义，P=〇 · 016，0R=3 · 397(1 · 209-9 · 546)。
[0008] 为此，本申请人设计了一种检测FoxHl基因 SNP位点rs750472基因型的方法，用来 检验FoxHl基因 SNP位点rs750472的基因型，该结果可用于室间隔缺损型心脏病的辅助判 断。
[0009] 本发明的第一个目的是提供一种检测F0XH1基因 SNP位点rs750472基因型的方法， 步骤如下： (1) 构建重组阴性质粒和重组阳性质粒;所述重组阴性质粒的核苷酸序列参见序列表 中SEQ ID No. 1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2; (2) 提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的 外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据； 作为优选，所述HRM分析的条件为:94°C 90s;60°C 30s;83-94°C收集数据，温度上升速 率为 0.06°C/s; (3)根据收集数据绘制高分辨率溶解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的溶解曲 线判断待测样本F0XH1基因 SNP位点rs750472的基因型： 与重组阴性质粒的溶解曲线重合则F0XH1基因 SNP位点rs750472的基因型为TT; 与重组阳性质粒的溶解曲线重合则F0XH1基因 SNP位点rs750472的基因型为GG; 在重组阴性质粒和重组阳性质粒的溶解曲线之间的则F0XH1基因 SNP位点rs750472的 基因型为TG。
[0010]作为优选，所述PCR扩增时所用引物为（1)或(2)中的一种： (1) 上游引物:F0XH1-F 5 '- ACCAGGGAAGACGGGATAAAGT-3 ' ； 下游引物:F0XH1-R 5'- TCTAGTGGGGGCTTCTCCTGA-3' ； (2) 与（1)中的互补序列。
[0011] 上述引物的衍生序列也在本发明的保护范围内，所述衍生序列为向5'端和/或3' 端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
[0012] 作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为： Green-2-Go qPCR Mastermix(含EvaGreen) 5μ1 引物 F(10yM) Ο.?μL 引物 R(10yM) Ο.?μL 模板(50ng/yl) 0·5μ1 ddH20 4.3μ1 总体积 lOul。
[0013] 作为优选，所述PCR扩增时的反应条件为:94°C预变性3min; 94°C变性10s，60°C退 火/延伸20s; 40个循环。
[0014] 本发明的第二个目的是提供一种用于检测F0XH1基因 SNP位点rs750472基因型的 试剂盒，所述试剂盒包括重组阴性质粒、重组阳性质粒和用于扩增质粒的引物;所述重组阴 性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序 列表中SEQ ID No.2。
[0015] 作为优选，所述引物的序列为(1)或(2)中的一种： (1) 上游引物:F0XH1-F 5 '- ACCAGGGAAGACGGGATAAAGT-3 ' ； 下游引物:F0XH1-R 5'- TCTAGTGGGGGCTTCTCCTGA-3' ； (2) 与（1)中的互补序列。
[0016] 作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为： Green-2-Go qPCR Mastermix(含EvaGreen) 5μ1 引物 F(10yM) Ο.?μL 引物 R(10yM) Ο.?μL 模板(50ng/yl) 0·5μ1 ddH20 4.3μ1 总体积 10μ1; 作为优选，94°(3预变性311^11;94°(3变性1〇8,60°(3退火/延伸2〇8;40个循环。
[0017] 本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下： (1)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的 外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析； 所述HRM分析的条件为:94°C 90s; 60°C 30s； 83-94°C收集数据，温度上升速率为0.06°C/s; (2)根据收集数据绘制高分辨率溶解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的溶解曲 线判断待测样本FOXH1基因 SNP位点rs750472的基因型： 与重组阴性质粒的溶解曲线重合则FOXH1基因 SNP位点rs750472的基因型为TT; 与重组阳性质粒的溶解曲线重合则FOXH1基因 SNP位点rs750472的基因型为GG; 在重组阴性质粒和重组阳性质粒的溶解曲线之间的则FOXH1基因 SNP位点rs750472的 基因型为TG。
[0018] 本发明的第四个目的是提供序列表中SEQ ID No. 1、序列表中SEQ ID No.2在制备 检测F0XH1基因 SNP位点rs750472基因型的试剂盒中的应用。
[0019] 本发明的第五个目的是提供序列表中SEQ ID No. 1、序列表中SEQ ID No. 2、权利 要求5-8任一所述的试剂盒在制备辅助判断室间隔缺损型心脏病的试剂中的应用。
[0020] 本发明的方法能够准确检测FoxHl基因 SNP位点rs7504