Sept9基因甲基化检测引物探针体系及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 06-甲基鸟噪呤-DNA甲基转移酶（06-methylguanine-DNA methyhransferase， SEPT9)是一种DNA修复酶，是人类细胞中唯一的能去除DNA上鸟嘌呤06位点上致细胞毒性和 突变的烷化剂加合物，使损伤的鸟嘌呤恢复，从而能够保护细胞免受抗烷化基团的损害。启 动子甲基化是SEPT9基因最常见的异常，与SEPT9蛋白的表达密切相关，导致该基因转录停 止，蛋白表达减少。
[0003] 有研究显示在胶质瘤中SEPT9基因启动子甲基化发生率越高，SEPT9含量越低，月中 瘤恶性程度就越高。SEPT9基因启动子甲基化还可用于临床上评估不同胶质瘤患者烷化剂 化学治疗疗效。在恶性胶质母细胞瘤中，SEPT9启动子甲基化作为预测因子预测烷化剂如替 莫唑胺(ΤΜΖ)治疗的获益已得到验证，加拿大国家癌症研究所(NCIC)和欧洲癌症研究和治 疗组织(EORTC)研究表明SEPT9基因启动子甲基化的神经母细胞瘤患者接受替莫唑胺治疗 后存活时间显著延长。SEPT9基因甲基化是胶质瘤化疗效果好的因素之一，检测胶质瘤病人 血清中SEPT9基因启动子甲基化状态可用来预测病人的预后及制定个体化的化疗方案，这 将在提高化疗疗效，改善病人预后方面有着十分重要的意义。研究也显示结直肠癌生成期 间的SEPT9表观遗传沉默与CpG岛在其启动子高甲基化有关;此转录后基因沉默造成的结果 是〇 6-烷基鸟嘌呤加合物的DNA修复被削弱，并且对烷化剂尤其是达卡巴嗪和其口服前药替 莫唑胺的化疗敏感性增加。另外，骨肉瘤SEPT9基因甲基化状态与化疗疗效明显负相关， SEPT9基因启动子甲基化状态在判断骨肉瘤患者化疗疗效中具有重要意义。
[0004] 目前，检测甲基化的方法包括：1、甲基化敏感的限制性内切酶(Methylat ion-sensitive restriction Endonuclease ，MS_RE) 法。但识别的CG序列因酶的识别位点有限 故有局限性，且存在酶不完全消化引起的假阳性问题；2、甲基化特异性PCR法 (Methylation-specific PCR，MSP)，是目前较为常见的检测基因甲基化的方法。MSP法的原 理是首先用亚硫酸盐修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶， 而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR扩增，最后通 过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。但是该方法对引物设计 要求非常高，一般会因为亚硫酸盐过度的处理，使得模板很难扩增出来。MSP法目前多结合 巢式PCR法。巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增。第一对PCR 引物扩增片段和普通PCR相似;第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段 的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的 好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩 增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。MSP法结合巢式PCR扩增的方法是设计针对 没有变化的模板的一组引物;针对变化了的模板的一组引物;看哪组引物能扩增出来从而 判断模板有没有变化，如果模板没变化，就表示模板被甲基化了。MSP法结合巢式PCR扩增的 方法能提高单一 MSP法的特异性，但操作时间长，且相比MSP法同样存在重亚硫酸盐处理不 完全导致的假阳性修饰过程中的pH值要绝对准确、所有试剂要求新鲜配置，并且需要反复 摸索找出合适的反应时间，造成整个检测过程繁琐，且不能做到定量检测，存在较高的假阳 性率;也存在亚硫酸盐处理过度，造成扩增困难的情况；3、甲基化敏感性解链曲线分析法 (MS-High Resolution Melting Cu rve，MS_HRM)，操作繁琐，假阳性率高，且不适于大量样 本的检测；4、荧光法(Methylight)，由于探针的局限性，一般没有合适的对照体系，假阳性 率较高；5、亚硫酸氢盐基因测序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)，是PCR联合Sa nger 测序技术，结果准确，但过程繁琐，不适合大批量检测，且价格昂贵不能广泛使用。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种方案简洁，灵敏度高，准确率高的SEPT9基因 甲基化检测试剂盒，以及其检测引物探针和检测体系。
[0006] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种SEPT9基因甲基化检测 弓丨物探针，包括用于判定基因组DNA质量的引物探针组X、用于判定甲基化转化率的引物探 针组Y和用于检测SEPT9基因启动子甲基化情况的引物探针组Z;
[0007] 所述引物探针组X包括正向引物a、反向引物a和探针a;
[0008] 所述引物探针组Y包括正向引物b、反向引物b和探针b;
[0009] 所述引物探针组Z包括正向引物b、反向引物b、探针c和探针d;
[0010]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示；
[0011]所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0012]所述探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0013]所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0014] 所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[0015] 所述探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0016] 所述探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
[0017] 所述探针d的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
[0018] 所述探针a、探针b和探针c的5'端设有报告荧光基团，所述探针a、探针b、探针c和 探针d的3 '端设有淬灭荧光基团。
[0019] 上述各引物应用于PCR反应中的终浓度为0.4μΜ;各探针应用于PCR反应中的终浓 度为0.2μΜ。
[0020] 上述探针a、探针b和探针c的5'端设有相互区别的报告荧光基团。
[0021] 上述相互区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或 Cy3，第三种是Cy5或R0X;所述淬灭荧光基团是BHQ1。
[0022] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述引物探针的 SEPT9基因甲基化检测试剂盒。
[0023]本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种SEPT9基因甲基化检测 体系，包括用于判定基因组DNA质量的反应体系X、用于判定甲基化转化率的反应体系Y和用 于检测SEPT9基因启动子甲基化情况的反应体系Z;
[0024] 所述反应体系X包括正向引物a、反向引物a、探针a、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和纯 水；
[0025] 所述反应体系Y包括正向引物b、反向引物b和探针b、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和纯 水；
[0026] 所述反应体系Z包括正向引物b、反向引物b、探针c、探针d、PCR缓冲液、dNTPs、 MgCh和纯水；
[0027]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；
[0028] 所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0029] 所述探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0030] 所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0031] 所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[0032] 所述探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0033] 所述探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
[0034] 所述探针d的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
[0035] 所述探针a、探针b和探针c的5'端设有报告荧光基团，所述探针a、探针b、探针c和 探针d的3 '端设有淬灭荧光基团。
[0036]上述各反应体系的组分中包括十倍浓度的PCR缓冲液1体积，2mM的dNTPs试剂1体 积，15mM的MgCl2溶液1体