检测杂合性dmd基因缺失的方法及所用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于二代测序检测基因缺失突变的 方法。
【背景技术】
[0002] DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)是一种严重的神经肌肉遗传性疾病，一种X 染色体连锁隐性遗传病，国内一般称为杜氏型肌营养不良或假肥大型进行性肌营养不良。 发病情况比较复杂，约有65 %左右与遗传有关，35 %为个体突变所致。DMD是肌营养不良中 发病率最高的一型。还有一种良性亚型，叫BMD(Becker Muscular Dystrophy)，称为贝克型 肌肉营养不良。由于体内能够保留部分的不完整的抗肌萎缩蛋白，患者通常较晚出现症状 (5-15岁），临床表现较轻，发展相对缓慢，病程较DMD更长，全国每年新增约3000名DMD/BMD 病人，患者总数约有10万人。
[0003] 由于基因定位于Xp21.1_p21.3,为迄今为止发现的人类最大基因。该基因的缺失、 重复或点突变，造成肌营养不良病人无法合成正常的抗肌萎缩蛋白（Dystrophin蛋白），肌 细胞膜失去完整骨架，造成肌细胞膜损伤，肌肉细胞进行性破坏。临床表现主要为骨骼肌进 行性萎缩，肌力逐渐减退，丧失活动能力。由于肌肉细胞呈进行性破坏，若不治疗干预，DMD 病人通常在12岁前失去行走能力，最终因心肺功能衰竭在20~30岁死亡。由于体内能够保 留部分的不完整的抗肌萎缩蛋白，BMD病人通常较晚出现症状(5-15岁），临床表现较轻，发 展相对缓慢，寿命通常在50岁以上。
[0004] 由于DMD暂无有效的药物进行治疗，因此，进行孕前筛查然后预防该缺陷病婴儿的 出生是最有效的的措施。
[0005] 然而，DMD是人体最大的基因，包含79个外显子，DMD病人是由于某个(或多个)外显 子缺失、重复或点突变造成的。确诊DMD，首选抽血检查遗传基因。这是无创性的并可准确提 供多种信息的检测手段。目前的MLPA法可以检测缺失和重复，但存在较大的假阴性情况，而 利用二代测序，可以检测点突变以及20bp以内的小片段缺失插入，而对杂合性的大片段缺 失和重复则无能为力。而qPCR法只能验证已知的缺失突变，不能对未知区域的缺失进行检 测 。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种利用二代测序技术(包括检测杂合性DMD基 因缺失的引物），对杂合型的DMD基因大片段缺失进行检测;从而找到DMD疾病的携带者。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
[0008] 对DMD基因的79个外显子区域设计产物为370-400bp的特异性引物，每对特异性引 物至少有20bp的重叠区，在特异性引物的5'端，设计一段通用序列(uniseq)以及5个连续的 N碱基，称为标签，这样正向和反向各有5个随机的碱基N，总共10个N;uniSeqF通用序列为： CTACACGACGCTCTTCCGATCT;uniseqR 通用序列为 GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC。所有序列都进 行锁核酸修饰，引物在1 i f e公司（原英俊公司)合成，结构中β-D-咲喃核糖的2 ' -ο、4 ' -c位通 过缩水作用形成刚性结构，从而实现锁核酸修饰;序列如表1所示：
[0009] 表1、DMD基因的79个外显子的引物序列
[0010]
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[0017] 备注说明：uniseqF/uniseqR是用于二代测序，是测序引物结合区，正反向各5个 NNNNN才是标签，因此本发明的标签是10个碱基。N在分子生物学中是代表A、G、C、T中的任意 一个碱基，所以5个NNNNN的排列组合就是4的5次方，10个N，就有4的10次方的组合。
[0018] 本发明的具体使用方法如下：
[0019] 1.将以上的特异性引物与基因组DNA进行扩增，设置两个PCR循环;将5个N和通用 弓丨物序列引入至IjDNA链中；体系和条件如下：
[0020]
[00211备注说明：上述引物混合液包含表1中的所有引物，每对引物的浓度均为10pM。
[0022] 将PCR反应管放于PCR仪上，运行下表所示程序：
[0023]
[0024] 2.按照Beckman的纯化磁珠的标准纯化步骤进行纯化，除去多余的PCR引物，然后 利用两端的通用引物进行PCR扩增，条件如下：
[0025]
[0026] 引物F:
[0027] AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCTACACGACGCTCTTCCGATCTo
[0028] 下划线部分正好与uniseqF-样，用于第二轮的扩增；同时引入一个测序接头。
[0029] 引物R:
[0030] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC〇
[0031] 下划线部分正好与uniseqR-样，用于第二轮的扩增;同时引入一个测序接头。
[0032] 将PCR反应管放于PCR仪上，运行下表所示程序：
[0033]
[0034] 进行高通量测序，测序数据与DMD参考序列（http : // www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/NM_004006.2)比对，对于比对上的序列统计正反向总共10个N碱基的序列，对具有 相同标签(即10个碱基序列完全相同的）的序列视为一条，最后统计序列数。
[0035] 本发明的原理如图1所示。
[0036] 最终统计某外显子的标签数，通过该标签数来反应原始模板量。
[0037] 3.结果判断，将待测样本的相对标签数(相对标签数=该外显子标签数/平均标签 数)与阴性样本（即，已知没有DMD患病的健康人样本)的相对标签数进行比较，并判断：比值 等于〇的，为纯合型缺失，大于〇且低于H/2的为杂合型缺失，高于1/2低于)0.6的为 疑似杂合型缺失，不容易判断，需要进一步验证。大于〇. 6的为正常。
[0038]本发明的关键优势：
[0039] 对于人类基因组DNA，100ng的量约含15000个拷贝，而某个基因，在正常人中都会 有两个拷贝，分别一个来自父方，一个来自母方，而当某些病变情况下，其中一方的发生了 缺失或重复，就会导致拷贝数发生变化，杂合型缺失情况下就会变成7500个拷贝，杂合型重 复的情况下就会变成22500个拷贝。而传统的二代测序都是基于PCR扩增，而PCR扩增是非线 性的，20几个循环的扩增将会破坏线性关系，导致终产物的拷贝数没有差别。而传统二代测 序的分析也只统计终产物的测序深度，因此，就不能对杂合型缺失进行判断。
[0040] 而本发明最重要的一点是引物标签技术，正反向引物各加5个N碱基，就能产生4的 10次方的标签数量，约100万种标签。利用这100万不同的标签去结合15000个拷贝的模板， 通过概率计算，2个模板具有相同标签的概率为1万亿分之一，并且后续PCR扩增，只是将相 同的标签扩增出，不会引入新的标签，因此标签的总数量，与模板的拷贝数相关，并且在一 开始时就确定了，不会随着PCR循环数的变化而变化。模板的拷贝数越多，检测到的标签数 量就会越多。同时本发明还包括一系列的数据比对与标签归一化处理等技术，从而能对杂 合型缺失进彳丁精确检测。
[0041] 本发明中所用到的试剂的货号及供应商：
[0042] 1.引物:上海英潍捷基(现被thermo fisher收购)贸易有限公司；
[0043] 2.血液DNA提取试剂盒:Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒(德国快而精公 司，货号69506)
[0044] 3. 2X多重PCR酶混合液:天根生化科技(北京)有限公司货号:KT109
[0045] 4.PCR产物纯化磁珠：美国Beckman Coulter,公司，货号Α63880
[0046] 综上所述，本发明是基于二代测序，利用本发明的方法，可以检测纯合型、杂合型 的缺失，从而可以有效的检测DMD遗传病的携带者，从而通过产前诊断、试管婴儿等方法指 导孕妇生育健康的婴儿。
【附图说明】
[0047] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0048]图1为本发明的原理图。
【具体实施方式】
[0049]实施例1、应用本发明，对1例DMD男性病人，1例DMD病人母亲以及1例正常男性的 DMD基因进彳丁检测。
[0050] 一、实验方法与步骤
[0051 ] 1. DMD病人及其家属的样本获得:经过某医院确诊的DMD病人，EDTA抗凝取血2ml。 用Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒（德国快而精公司，货号69506)进行血液中的 基因组DNA提取，Nanodrop测浓度为50ng/ul。同时该DMD病人及其家属的样本已利用上海基 康生物公司的MLPA法验证仅为DMD的51号外显子缺失。
[0052] 2.从NCBI数据中获得DMD基因每个外显子的序列，设计引物（可利用primer5软 件），引物见表1，引物委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，HPLC纯化。
[0053] 3.将以上的特异性引物混合后对基因组DNA进行扩增，设置两个PCR循环，将5个N 和通用引物序列引入到DNA链中；体系和条件如下：
[0054] 5个N的引物，其实就是有4~5 = 1024种排列组合。
[0055]
[0056] 将PCR反应管放于PCR仪上，运行下表所示程序：
[0057]
[0058] 4.按照Beckman的纯化磁珠的标准纯化步骤进行纯化，除去多余的PCR引物，然后 利用两端的通用引物进行PCR扩增，通用引物的序列如下：
[0059] 引物F:
[0060] AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
[0061] 下划线部分正好与uniseqF-样，用于第二轮的扩增;同时引入一个测序接头。
[0062] 引物R:
[0063] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC
[0064]下划线部分正好与uniseqR-样，用于第二轮的扩增；同时引入一个测序接头。 [0065] 扩增条件如下：
[0066]
[0068]
[0069]
[0070] 5.按照Beckman的纯化磁珠的标准纯化步骤进行纯化。
[0071] 6.按标准流程进行Illumina上机，每PCR产物至少1000X测序深度。
[0072]对Illumina Miseq测序仪产生的原始数据，进行数据分析，采用BWA与参考基因组 进行比对。并统计每个扩增子正反向的标签数量，十个碱基相同的标签视为一个标签。 [0073]表2、测序后三个样本每个外显子的标签数量 [0074]
[0075]
[0076]结果判断规则，将待测样本的相对标签数(相对标签数=该外显子标签数/平均标 签数)与阴性样本(即，已知没有DMD患病的健康人样本)的相对标签数进行比较，并判断：比 值等于〇的，为纯合型缺失，大于〇且低于H/2的为杂合型缺失，高于1/2低于)0.6的 为疑似杂合型缺失，不容易判断，需要进一步验证。大于0.6的为正常。
[0077] 举例如下：
[0078] 如第51号外显子:携带者51号外显子相对标签数为105/295 = 0.356，DMD患者51号 外显子相对标签数为0/302 = 0,对照51号外显相对标签数为238/305 = 0.780,携带者/对照 的51号外显子相对标签数比值为0.356/0.780 = 0.456，大于