一种快速灵敏的gⅱ型诺如病毒微阵列基因芯片检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种快速灵敏的GII型诺如病毒微 阵列基因芯片检测方法。
【背景技术】
[0002] 诺如病毒感染性腹泻是由诺如病毒属病毒引起的腹泻，具有发病急、传播速度快、 涉及范围广等特点，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。美国每年有2 300万例非细菌性 急性胃肠炎由诺如病毒引起，占各种肠道传染病的60%，并常引起医院感染暴发。Hamano等 报道日本Okay ama地区77 %急性暴发性非细菌性胃肠炎与诺如病毒有关。Wu等报道2004年 11月23日至2005年3月9日台湾10个县报告的12次暴发性胃肠炎疫情中诺如病毒都被检出。 我国学者用RT-PCR和序列分析证明不同基因型杯状病毒感染在我国婴幼儿中普遍存在。 2006年，我国病毒性腹泻监测网络监测5岁以下婴幼儿腹泻患者粪便标本中杯状病毒检出 率为14.4%。国内血清流行病研究亦表明我国成人诺如病毒既往感染率高达90 %左右。目 前我国流行的人类诺如病毒主要以GII .4为主。
[0003] 目前检测诺如病毒的方法有电镜观察、免疫学检测和分子生物学检测方法。电镜 法因为诺如病毒缺乏典型的杯状病毒特征，而且常因病毒量少而难以发现。且检测结果受 操作者熟练程度的影响很大，加上检测灵敏度相对较低，因此不适于临床检测和大规模流 行病学调查。免疫学方法是基于抗原和抗体之间的相互作用检测各种物质（如药物、激素、 蛋白质、细菌等）的分析方法。免疫学方法包括胶体金标记免疫层析法，酶联免疫吸附分析 法，化学发光免疫分析，荧光免疫分析，免疫聚合酶链法等一系列分析方法。这些方法成本 较低，操作简单，但是其灵敏度较低，容易造成漏检的现象。
[0004] 进入本世纪后，随着分子微生物生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的 鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平 上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核 酸探针(Nuclear acid probe)和聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)以及新近发 展起来的基因芯片(DNA microarray)技术的建立与广泛应用，为全面快速准确地分析鉴定 水体、空气、土壤和食品等环境中的各种微生物提供了一种崭新的技术工具和平台。目前， 基因芯片已广泛应用于包括环境微生物、微生物生态，人类、兽医、食品和植物的诊断，以及 水质监控、工业微生物等等，而基因芯片应用于食源性致病微生物检测的研究也不断发展。
[0005] 基因芯片技术利用待检测样品的基因组序列设计针对各种微生物的特异探针，将 该探针(寡核苷酸)点样于芯片表面，同时在探针两侧设计PCR引物，在引物合成过程中对其 5'端进行荧光标记或在PCR过程中加入荧光标记的dNTP，这样利用PCR扩增的方法即可得到 标记有荧光染料的待检测靶标，然后用含有待检测样品特异探针的微阵列芯片与标记的靶 标杂交，荧光标记的DNA分子与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈 现出荧光信号，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在GII型 诺如病毒。
[0006] 本发明整合了聚合酶链式反应(PCR)和微阵列这两种强大的分子生物学技术，根 据GΠ . 4诺如病毒保守基因片段设计引物和探针，进行RT-PCR反映，把RT-PCR杂交的探针直 接固定在微阵列中的杂交舱中，与RT-PCR反应室在同一张芯片上。RT-PCR反应结束后可以 直接加入杂交液进行杂交，操作简单，节省时间。本发明的检测方法可运用于GII型诺如病 毒快速灵敏的检测，作为免疫学方法及镜检法的可靠补充，提高检测的准确性和时效性，可 大大地降低检测的周期。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速灵敏的GII型诺如病毒微阵列基因芯 片检测方法。通过本发明可大幅度提高进出口 口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减 少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地 防止诺如病毒引起的腹泻传染病的发生，同时也可应用于医院诺如病毒感染的检测。
[0008] 本发明所提供的快速灵敏的Gn型诺如病毒微阵列基因芯片检测方法，包括如下 步骤：
[0009] (1)粪便样本RNA液提取；
[0010] (2)RT-PCR 扩增：
[0011] a.RT-PCR反应体系包括:PCR反应缓冲液，特异性正、反向引物，PCR Grade H20， PCR质控品，逆转录/DNA聚合酶液，RNA提取液；
[0012] b.将RT-PCR反应液加入已固化特异性探针的芯片内，将芯片放入反应室内进行扩 增反应；
[0013] 所述的特异性引物根据RdRP基因片段、0RF1与0RF2交界处基因片段两段保守基因 进行设计;所述的特异性探针是根据特异性引物扩增区内设计能够区别其他物种，特异性 引物和探针为：
[0014] RdRP基因片段
[0015] GIIl-F:5'-GAGTATGGTCTCAAGCCAACCCGTCC-3' (SEQ ID NO 1)
[0016] GIIl-R:5'-ACGTGCTCAAGTCTGAGAACCTCATC-3' (SEQ ID NO 2)
[0017] Probel:5'-TACTTAGACAGATGTATTGGAC-3' (SEQ ID NO 3)
[0018] 和0RF1与0RF2交界处基因片段(4993-5336)
[0019] GΠ 2-F:5'-CGTGCCCAGCCAAGAGCGATGTTCAG-3' (SEQ ID NO 4)
[0020] GII2-R:5'-ATCAGGGCCCAAGGGCGCGCTCCA-3' (SEQ ID NO 5)
[0021] Probe2:5，-GCGATCGCAATCTGGCTCC-3' (SEQ ID NO 6)
[0022] 或根据RdRP基因片段、0RF1和0RF2交界处基因片段两段保守基因之一设计的特异 性引物和探针：
[0023] RdRP基因片段
[0024] GIIl-F:5'-GAGTATGGTCTCAAGCCAACCCGTCC-3' (SEQ ID NO 1)
[0025] GIIl-R:5'-ACGTGCTCAAGTCTGAGAACCTCATC-3' (SEQ ID NO 2)
[0026] Probel:5'-TACTTAGACAGATGTATTGGAC-3' (SEQ ID NO 3)
[0027] 或0RF1与0RF2交界处基因片段(4993-5336)
[0028] GII2-F:5'-CGTGCCCAGCCAAGAGCGATGTTCAG-3' (SEQ ID NO 4)
[0029] GII2-R:5'-ATCAGGGCCCAAGGGCGCGCTCCA-3' (SEQ ID NO 5)
[0030] Probe2:5，-GCGATCGCAATCTGGCTCC-3' (SEQ ID NO 6)
[0031] (3)杂交:PCR扩增完后，将杂交反应液加入芯片，使杂交液和扩增液都进入到杂交 舱内杂交反应；
[0032] (4)清洗:杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；
[0033] (5)结果判读。
[0034] 步骤（1)中所述的RNA提取可使用RNA提取试剂盒提取诺如病毒RNA，取100ul液体 奠便样本或者〇. lg的固体奠便溶于1ml生理盐水，混勾后，5〇〇〇rpm离心，取上清液按照试剂 盒说明书中的提取步骤提取RNA。
[0035] 步骤（2)中所述的RT-PCR反应体系为：2X RT-PCR反应液12.5ul，引物混合液 2.5ul，14mM MgS04 2.5ul，PCR Grade H20 lul,逆转录酶/DNA聚合酶液lul，PCR质控2ul, 样本5ul。
[0036] 步骤(2)所述的RT-PCR反应体系中逆转录酶/DNA聚合酶为Superscript III RT/ Platinum Taq Mix。
[0037] 步骤(2)所述的RT-PCR扩增的反应条件是:50°C逆转录20min，95°C预变性2min;95 °C 变性 15s，56°C 退火 40s，72°C 延伸 5〇8,40个循环，72°(3延伸111^11。
[0038] 步骤(2)所述的PCR扩增与步骤(3)所述的杂交在芯片仪上完成。
[0039]本发明针对GII型诺如病毒保守基因，设计引物，在引物扩增区内设计能够区别其 他诺如病毒及亲缘关系较近的物种的特异性探针，对两段保守基因同时设计引物和探针可 提高GII型诺如病毒的特异性。通过探针特异性验证、探针灵敏度实验、方法特异性实验等 证明该方法可以检测GII型诺如病毒，与常规PCR方法比较，检测灵敏度与荧光PCR扩增基本 近似，不仅可以满足日常疫情安全检测的要求，甚至可以满足临床样品的检测要求。本发明 与现有检测方法相比，将RT-PCR的扩增过程和杂交检测过程浓缩到一张芯片上检测，大大 缩减了检测的时间和复杂性，检测设备简单易于携带。检测灵敏度与实时荧光方法基本一 致，大大提尚了当如的检测能力。而从样品米集到检测总时间完全可以在3小时内完成，有 益于快速准确的检测GII型诺如病毒。
【附图说明】
[0040] 图1实施例1灵敏性实验中实时荧光PCR方法检测结果。
[0041] 图中检测到的分别是提取液原液和ΠΓ1稀释液。
[0042] 图2实施例1中芯片法检测到的GII型诺如病毒核酸ΠΓ1稀释液。
[0043] 图3实施例1中芯片检测法的特异性结果。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0045] 实施例1 GII型诺如病毒芯片检测特异性与灵敏性
[0046] 一、实验步骤
[0047] 1.粪便样本的采集
[0048